Форум
главная страница
‹-  Ветеринарные статьи
 
И.Л. Обухов, Г.А. Шипулин, К.Н. Груздев
Молекулярно-генетический подход в диагностике хламидиозов животных и птиц на основе полимеразной цепной реакции

   Проанализированы достоинства и недостатки современных лабораторных методов диагностики хламидиозов животных и птиц. Рассматривается принцип метода полимеразной цепной реакции, обсуждаются перспективы его использования в практической ветеринарии.
   Хламидиозная инфекция широко распространена среди практически всех видов млекопитающих и наносит существенный экономический ущерб различным отраслям животноводства и птицеводства, вызывая гибель животных, патологию их воспроизводительных органов, аборты, рождение мертвого или нежизнеспособного приплода. Больные животные часто становятся источником инфекции работников животноводческих хозяйств, что приводит к возникновению эпидемических вспышек. Распространенность возбудителей хламидиозов в природе среди диких животных и особенно птиц представляет постоянную угрозу спорадических заболеваний для людей, профессионально не занятых в сельском хозяйстве (1-3).
   Особенностью хламидиозной инфекции, значительно усложняющей эпидемиологический надзор за ней, является часто хроническое, со стертой клинической картиной или латентное ее течение (4). Следовательно, в системе проведения ветеринарно-санитарных мероприятий по своевременной профилактике, а также специфическому лечению хламидиозов животных и людей важное значение имеет как можно более раннее и достоверное обнаружение возбудителя при разных формах заболевания. С этой целью на протяжении последних лет был разработан целый ряд лабораторных методов прямой и косвенной диагностики хламидиозов.
   В настоящее время общепризнанным эталоном для прямых методов выявления хламидий считается выделение возбудителя в культуре клеток. Однако этот метод имеет недостатки, существенно затрудняющие его широкое использование в практической ветеринарии. Прежде всего, это высокий риск инфицирования персонала, а следовательно, необходимость проведения работ по выделению возбудителя в специальной режимной лаборатории. Кроме того, культуральный метод трудоемок и занимает много времени. Несмотря на то, что для высева патогена подходит практически любой материал от инфицированного животного, успех исследования во многом зависит от скорости транспортировки проб в лабораторию и соблюдения условий доставки образцов (специальные транспортные среды, охлаждение, добавление антибиотиков, предварительная очистка материала от токсичных для клеток веществ и т.д.) (1).
   Требование наличия живого возбудителя в анализируемой пробе значительно снижает чувствительность культурального метода на заведомо положительных образцах. Так, при выделении бактерий Chlamydia psittaci в культуре клеток из 144 проб, взятых от больных орнитозом птиц, положительные результаты были получены только в 45 случаях (31 %), причем специфичность метода составила 94,1 % (5). Низкая специфичность культурального метода наблюдается, как правило, если для учета результатов анализа используют исключительно микроскопию.
   В настоящее время культуральный метод все чаще применяют в общей схеме анализа только на первом этапе накопления специфических антигенов, которые затем выявляют методами иммуноферментного анализа или иммунофлуоресценции, что существенно повышает специфичность и практически не влияет на чувствительность диагностики.
   В связи с этим предпринимаются попытки заменить метод культурального выделения хламидий другими методами их прямого обнаружения. Так, в последние годы большое значение приобрел подход, основанный на выявлении антигенов бактерий Ch. psittaci методом АГ-ИФА, имеющим по сравнению с культуральным следующие достоинства: возможность одновременного анализа большого числа образцов, быстрота (продолжительность анализа составляет 4 ч), безопасность для персонала. Поскольку с помощью этого метода выявляются как живые, так и неживые возбудители, то возможна работа с инактивированным материалом, в связи с чем существенно упрощаются требования к условиям транспортировки проб. Это расширяет возможности практического использования метода АГ-ИФА. Вместе с тем для ИФА-детекции антигенов так же, как и для культурального метода, характерны низкая чувствительность и специфичность. Например, при анализе методом АГ-ИФА 144 заведомо положительных образцов фекалий и органов животных чувствительность и специфичность составили соответственно 51 и 93,3 % (5). Необходимо подчеркнуть, что в отличие от культурального метода низкие значения чувствительности и специфичности метода АГ-ИФА связаны в первую очередь с его принципиальными возможностями. Другой причиной низкой чувствительности обоих методов может служить непостоянное выделение возбудителя больными животными, а также латентное протекание инфекции.
   Проблема низкой специфичности рассмотренных выше подходов была решена с введением в схему анализа методов прямой и непрямой иммунофлуоресценции в качестве подтверждающего теста. Метод прямой иммунофлуоресценции предусматривает использование меченных флуо-ресцеин-изотиоционатом (ФИТЦ) моноклональных антител как к липо-полисахаридному комплексу, так и к основному белку наружной мембраны (МОМР) хламидий. Для этого фиксированный на предметном стекле мазок обрабатывают флуоресцирующими антителами и после непродолжительной инкубации исследуют под флуоресцентным микроскопом. При непрямой иммунофлуоресценции проводят непрямое окрашивание антигенов в мазке. Вначале мазок инкубируют с немеченой антисывороткой животного, заведомо содержащей антитела к хламидиям, а затем образовавшиеся комплексы антиген-антитело окрашивают антивидовыми меченными ФИТЦ антителами к глобулинам сыворотки, используемой на первом этапе анализа. Методы иммунофлуоресценции не требуют много времени для проведения, а также наличия живого возбудителя в пробе; позволяют выявлять не только корпускулярные антигены, входящие в состав морфологических структур возбудителя, но и растворимые, содержащиеся во включениях. Кроме того, они обнаруживают высокую по сравнению с культуральным методом специфичность (до 99 %) (6).Однако следует отметить, что последняя может быть достигнута только за счет относительно более низкой чувствительности, так как вывод об отрицательном результате анализа делается лаборантом на основании отсутствия хламидий при просмотре достаточного количества эпителиальных клеток. Учитывая, что для достоверного выявления хламидий необходимо обнаружить определенное число элементарных телец во всем исследуемом образце, чувствительность анализа зависит также от опыта работы лаборанта (6).
   В последнее время для доказательства хламидиозов животных все чаще используют методы косвенной диагностики, среди которых основное место занимает иммуноферментное обнаружение в сыворотке крови больных животных специфических антител (метод АТ-ИФА). Реакция связывания комплемента (РСК), ранее используемая для этих целей, как было однократно показано, не обладает достаточной чувствительностью (1).
   При сопоставлении ИФА-метода выявления антител и прямых методов детекции хламидий, как правило, наблюдается высокий процент дискордантных результатов. Так, при анализе методом АГ-ИФА проб, полученных от 426 сероположительных попугаев, было обнаружено лишь 5,2 % выделителей возбудителя (7). Согласно другим данным, у 30 % сероположительных попугаев, импортированных в ФРГ, удалось выделить бактерии вида Ch. psittaci в культуре клеток, хотя только одной птице был поставлен диагноз "острый пситакоз". В то же время эпидемиологическое обследование в группах внешне здоровых дневных хищных птиц показало высокую долю носительства специфических к хламидиям антител (75-78,6 %) (5). Следовательно, положительные результаты, полученные методом АТ-ИФА, не являются доказательством активного инфекционного процесса и требуют обязательного подтверждения каким-либо прямым методом. Кроме того, эффективность карантинных мероприятий при возникновении угрозы рассеивания инфекции носителями прямо зависит от выбора такого метода диагностики, который позволил бы не только выявить асимптоматичных носителей, но и проследить за их лечением. В подобных ситуациях в связи с тем, что антитела к хламидиям имеют тенденцию достаточно долго сохраняться в крови животных после перенесенной инфекции, предпочтение должно отдаваться методам прямого обнаружения возбудителя.
   В настоящее время одним из наиболее перспективных методов прямой диагностики инфекций следует считать специфическую амплификацию нуклеиновых кислот in vitro и, в частности, наиболее разработанный вариант этой амплификации - метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
   В 1983 году Mullis (Cetus Corporation, США) открыл принцип избирательного умножения нуклеотидных последовательностей, за что был удостоен Нобелевской премии. В 1984 году исследователи этой корпорации разработали метод ПЦР, позволяющий всего за несколько часов получать миллионы копий выбранного фрагмента ДНК. В настоящее время этот метод практически вытеснил длительную и трудоемкую процедуру ДНК-гибридизации (8). Метод ПЦР позволил достигнуть больших успехов в области генетического картирования, изучения генетического полиморфизма, мутаций и генетических механизмов молекулярной иммунологии, а также в молекулярной вирусологии, онкологии, судебной медицине, диагностике наследственных и инфекционных заболеваний.
   Для амплификации специфического ДНК-фрагмента методом ПЦР достаточно знать нуклеотидную последовательность двух коротких участков ДНК, окаймляющих фрагмент-мишень. На основе этих последовательностей химически синтезируют два олигонуклеотида (праймера), которые необходимы для инициации полимеризации ДНК в каждом цикле ПЦР. Длина праймеров (обычно 20-30 нуклеотидов) должна быть такой, чтобы их последовательность была статистически уникальна и не встречалась в других участках ДНК, присутствующей в реакционной смеси. ПЦР включает серию повторяющихся циклов, каждый из которых начинается со стадии денатурации молекулы ДНК (рис.).

Схема ПЦР-анализа
Схема ПЦР-анализа клинического материала от инфицированного хламидиями животного:
   1 - подготовка проб к проведению ПЦР (очистка ДНК от ингибиторов ДНК-полимеразы и концентрирование);
   2 - плавление ДНК (первая стадия ПЦР-амплификации);
   3 - отжиг праймеров (вторая стадия ПЦР-амплификации);
   4 - достройка комплементарных цепей ДНК (третья стадия ПЦР-амплификации);
   5 - продукт ПЦР (ампликон);
   6 и 7 - соответственно злектро-роретическая и гибридизационно-ферментная детекция гродуктов ПЦР.


   На первой стадии при нагревании реакционной смеси до 96 "С разрываются водородные связи, соединяющие спиральные цепи. На второй стадии температуру реакционной смеси понижают до заранее определенных значений, соответствующих температуре отжига праймеров, что приводит к комплементарному их взаимодействию с последовательностями, окаймляющими фрагмент-мишень. Третьей стадией является элонгация праймеров в сторону фрагмента-мишени под действием ДНК-полимеразы. Продолжительность реакции обычно составляет 30-40 циклов. Поскольку число молекул ДНК удваивается в каждом цикле, то многократное их повторение приводит к экспоненциальному нарастанию (амплификации) количества специфических фрагментов ДНК (ампликонов), которое затем выявляют методом электрофореза или гибридизации с меченым ДНК-зондом.
   Возможность быстрого и практически полного обнаружения многих возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных в образцах крови, мочи, слюны, в различных тканях организма методом амплификации генов при помощи ПЦР была продемонстрирована уже через несколько лет после ее открытия. Было показано, что ПЦР обладает высокой чувствительностью и в то же время не требует, подобно серологическим методам, наличия иммунного ответа на проникновение возбудителя в организм хозяина, что дает возможность следить за ранними стадиями инфекции и выявлять ее латентное течение. Позже стали разрабатывать варианты ПЦР, позволяющие не только выявлять патогенные микроорганизмы, но и определять их концентрацию в биологическихсредах, активность в организме хозяина, а также различать патогенные формы одного и того же типа возбудителя.
   Для диагностики хламидиозов человека и животных ПЦР была впервые применена в 1989 году (9). На модельных системах культур клеток, инфицированных бактериями Ch. trachomatis или Ch. psittaci с известным титром, авторам удалось методом ПЦР дифференцировать эти виды рода Chlamydia и детектировать ДНК хламидий с чувствительностью 1 бактерия на 100 тыс. инфицированных эукариотических клеток. Кроме того, была показана высокая специфичность метода ПЦР: ни один из 13 представителей других родов бактерий не давал положительного ответа. Авторы разработали систему из четырех праймеров, ограничивающих два фрагмента длиной 240 и 119 нуклеотидов рибосомального гена (16S). Первая пара праймеров позволяла детектировать оба вида хламидий. Вторая пара праймеров обладала специфичностью только к бактериям Ch. psittaci. К сожалению, в этой работе был протестирован всего лишь один штамм Ch. psittaci, в связи с чем авторы не смогли сделать вывод о возможности детекции других представителей этого вида предлагаемыми праймерами.
   В 1991 году Rasmussen с соавт. предложили оригинальные прайме-ры и изучили их специфичность в ПЦР на препаратах ДНК, выделенных из 24 коллекционных штаммов Ch. psittaci (10). Подобранные праймеры соответствовали консервативным участкам гена главного поверхностного белка (МОМР) хламидий и ограничивали фрагмент длиной около 1000 нуклеотидов. Кроме того, был предложен зонд, комплементарный внутреннему участку амплифицируемого фрагмента. Полный ПЦР-анализ состоял из трех этапов: выделение ДНК, ПЦР и выявление продуктов ПЦР методом дот-гибридизации с радиоактивно меченным зондом. В сравнительных опытах установлено, что гибридизационный метод выявления хламидий на фильтрах не позволяет обнаружить менее 100 тыс. элементарных телец, в то время как чувствительность ПЦР составляет 10 хламидий в пробе, причем 22 из 24 исследованных образцов штаммов Ch. psittaci дали положительный ответ в ПЦР. Поскольку штаммы бактерий с отрицательным в ПЦР ответом были исходно выделены из конъюкти-вальной жидкости коалы, можно думать о значительном отличии ген.-МОМР этих штаммов от всех остальных. Несмотря на то, что исследования были выполнены на упрощенных модельных системах, авторы сделали важный вывод о том, что чувствительность ПЦР определяется всеми тремя этапами ПЦР-анализа, при этом большое значение имеет подготовка проб.
   Следовательно, уже в первых работах, посвященных применению ПЦР для обнаружения хламидий, отмечены чрезвычайно важные для диагностики хламидиозов особенности этого метода: высокая чувствительность и специфичность, способность идентифицировать виды хламидий. Позже высокие возможности ПЦР были подтверждены на клиническом материале. Например, Holland с соавт. использовали ПЦР для обнаружения и дифференцирования трех видов бактерий рода Chlamydia:
   Ch. trachomatis, Ch. psittaci, Ch. pneumoniae (11). С этой целью авторы разработали оригинальную систему ПЦР-детекции хламидий, состоящую из трех праймеров, комплементарных областям гена МОМР хламидий и рестриктазы EcoRI. Обнаружено, что вид Ch. trachomatis диагностируется всеми тремя праймерами, а три продукта ПЦР имеют сайг рестрикции EcoRI. Фрагмент гена МОМР бактерий Ch. psittaci амплифицировался только двумя праймерами и не расщеплялся этой рестрикгазой. Бактерии С/г. pneumoniae детектировались также одной парой праймеров, но специфичный фрагмент имел сайг рестрикции EcoRI. При этом была продемонстрирована высокая чувствительность и специфичность разработанного варианта ПЦР в модельных условиях. Кроме того, методом ПЦР протестировано несколько клинических образцов, дающих положительный ответ в культуре клеток, и получено 100 % подтверждение результатов.
   Аналогичный, но более простой вариант ПЦР предложили Rasmussen с соавт. (12). В области гена МОМР ими была найдена пара праймеров, консервативная для всех трех видов хламидий, но амплифи-цирующая вариабельный фрагмент ДНК. Поэтому после ПЦР проводили рестрикцию ферментами EcoRI и HindIII или Pstl. Этот вариант ПЦР успешно использовали для детектирования и дифференцировки двух штаммов Ch. pneumoniae, 11 штаммов Ch. psittaci и 10 сероваров С/г. trachomatis. С помощью этого метода были протестированы 15 клинических образцов, в 8 из которых культуральным методом выявлены бактерии С/г. trachomatis. ДНК хламидий обнаруживалась методом ПЦР в пяти образцах в том случае, если выявление ампликонов проводили электро-форетическим методом. В то же время наличие ДНК хламидий удалось доказать во всех 8 пробах после ПЦР с последующей радиоактивной гиб-ридизационной детекцией продуктов ПЦР.
   В 1991 году появилось сообщение Corcish с соавт. о первом применении метода ПЦР для диагностики пситакоза птиц в практической ветеринарно-диагностической лаборатории (13). Авторы предприняли беспрецедентные (и до настоящего времени) сравнительные исследования по тестированию проб экскрементов птиц методами ПЦР и имму-ноферментного выявления антигена. Вариант ПЦР, использованный в этой работе, был разработан Hewinson с соавт. (14) и представлял собой модификацию метода Rasmussen (10). В общей сложности двумя методами было исследовано более 1000 проб. Обнаружено, что детекция антигенов бактерий Ch. psittaci методом ИФА может давать до 75 % ложнопо-ложительных результатов. В то же время ПЦР, дополненная гибридиза-ционной детекцией ампликонов, выявляла в клиническом материале ДНК хламидий с показателями чувствительности и специфичности, близкими к 100 %. В отличие от анализа культуральным методом, занимавшего до 3 нед, результаты ПЦР обычно получали в течение 48 ч. На основании полученных данных авторы разработали рекомендации для проведения ПЦР-диагностики пситакозов птицы. По их мнению, используемые в настоящее время методы прямого обнаружения хламидий не обладают достаточной чувствительностью и специфичностью. Однако метод ПЦР позволяет достоверно судить об инфицированности птицы. В связи с тем, что возбудитель выделяется у больного животного непостоянно, необходимо исследовать не менее трех образцов экскрементов от одной и той же особи, взятых в течение 4-5 сут. При скрининговом обследовании птиц с помощью ИФА метод ПЦР должен быть использован в качестве подтверждающего теста. В случае обнаружения контактов заболевших пситакозом птиц или человека со здоровыми людьми или птицами метод ПЦР является методом выбора для лабораторной диагностики орнитоза у контакторов (13).
   Значение этой работы для практической диагностики хламидиозов птиц трудно переоценить. Однако предлагаемая авторами методика пригодна для решения только одной прикладной задачи - диагностики хла-мидиозов, вызванных бактериями вида Ch. psittaci. В настоящее время известно, что хламидиозы животных и птиц могут вызываться как минимум тремя из четырех выделенных видов хламидий: Ch. psittaci, Ch. trachomatis и недавно открытым Ch. ресогит (15). Кроме того, метод Corcish с соавт. требует использования радиоактивных изотопов, что делает его затратным, длительным и опасным для персонала и тем самым затрудняет его внедрение в лабораториях ветеринарной службы.
   Следующий большой вклад в разработку и внедрение метода ПЦР для диагностики хламидиозов животных и птиц внесли работы Kaltenboeck с соавт., в которых не только решен ряд основных задач практической ПЦР-детекции хламидий, но и доказаны неограниченные возможности использования ПЦР в молекулярной эпидемиологии хламидиозов (16-19). Для этих целей авторы сначала идентифицировали у 24 штаммов хламидий часть нуклеотидных последовательностей, составляющих 81 % целого гена МОМР. Коллекция штаммов включала представителей всех известных сегодня видов хламидий. Полученные последовательности были выравнены друг относительно друга и разбиты на четыре неперекрывающихся кластера, каждый из которых соответствовал одному из четырех видов хламидий. Затем были определены участки, строго консервативные для всех изолятов, и в этих консервативных областях, располагающихся по краям гена МОМР, выбрана система из четырех вложенных родоспецифичных праймеров таким образом, что внешние праймеры ограничивали фрагмент гена МОМР длиной 1120 нуклеотидов, а внутренние - фрагмент длиной 950 нуклеотидов. Продукты ПЦР, полученные с внешними праймерами, подвергали реамплифи-кации с внутренними, а фрагмент длиной 950 нуклеотидов выявляли методом электрофореза. Чувствительность этого нерадиоактивного варианта ПЦР позволяла детектировать не менее трех бактерий в пробе в присутствии фоновой нагрузки ДНК человека, эквивалентной 100 тыс. клеток.
   Авторам удалось подобрать систему видоспецифичных праймеров, каждый из которых с общим родоспецифичным праймером мог образовать фрагмент, длина которого была характерна только для одного вид-хламидий. Кроме того, они разработали систему более детального типи-' рования хламидий рестрикционным анализом видоспецифичных ПЦР-фрагментов. Для этого были подобраны рестриктазы, позволяющие не только оценивать результаты определения вида, получаемые при использовании видоспецифичных праймеров, но и проводить внутривидовую дифференциацию хламидий. Разработанная система была апробирована на клинических образцах молока, полученных от коров (п == 7) с маститом неясной этиологии. У двух из них были детектированы методом ПЦР бактерии вида Ch. psittaci. Рестрикционный анализ специфических ПЦР-фрагментов позволил определить вид и тип хламидий (птичий тип 2Ь).
   Эта работа, несмотря на небольшое число протестированных клинических проб, по-видимому, займет особое место в истории разработки метода ПЦР для диагностики хламидиозов животных. Впервые удалось на основе последовательностей одного гена-мишени создать универсальные родоспецифические праймеры, позволяющие с высокой чувствительностью диагностировать хламидиоз и сразу же давать видовую и типовую характеристику возбудителя. Ценность данных молекулярного типирования возрастает еще больше, если принять во внимание тот факт, что продукт гена, использованного авторами для типирования, может быть использован при разработке вакцин против хламидий. Следовательно, в этих экспериментах были показаны не только диагностические возможности метода ПЦР, но и одновременно на основе данных молекулярных исследований классифицирован возбудитель, что до сих пор представлялось невозможным.
   Таким образом, возможность применения ПЦР-диагностики хламид иозов животных в настоящее время продолжает изучаться. Рассмотренные нами данные литературы демонстрируют перспективы, которые открывают разработка и использование этого метода в диагностических ветеринарных лабораториях. Прежде всего, это быстрый и надежный диагноз, своевременная эффективная терапия и научно обоснованная профилактика хламидиозов. Дополнительная информация о разновидности возбудителя, легко получаемая методом ПЦР, позволит проводить эпидемиологический контроль и предотвращать распространение опасных штаммов хламидий.

ЛИТЕРАТУРА
   1. Бортничук В.А. Хламидиоз свиней. Киев, 1991.
   2. Обухов И.Л. Хламидиоз кошек. М., 1994.
   3. Терских И.И. Орнитоз и другие хламидийные инфекции. М., 1979.
   4. Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней /Под ред. В.И. Покровского. М., 1993, 1: 357-366.
   5. Gerbermann H., Jakоbу J.R., Kosters J. Chlamidienbefimde aus einer groberen Geifrogelhaltung. J. Vet. Med., 1990, 37: 739-738.
   6. Вяянанен П. Диагностика хламцдийных инфекций. В сб.: Диагностика и лечение хламидийных инфекций. М., 1987.
   7. Gerbermann H.,Janeczek F. Chlamydiose bei Vogein: gegenwartige Situation und altemativen der Diagnose und Belcampfung. Pract. Tieiarzt, 1991, 6: 521-528.
   8. Saiki R.K., Sharf S.,Faloona F. e.a. Enzymatic amplification ofb-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Sci., 1985, 230: 1350-1354.
   9. Pollard D.R., Туlег S.D., Ng С. W. e.a. A polymerase chain reaction (PCR) protocol for the specific detection of Chlamydia spp. Mol. Cel. Probes, 1989, 3: 383-389.
   10. Rasmussen S.J., Тimms P. Detection Chlamydia psittaci using DNA probes and the polymerase chain reaction. PEMS Microbiol. Lett., 1992, 77: 169-174.
   11. Hоlland S.M., Gауdes C.A., Quinn T.C. Detection and differention of Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci and Chlamydia pneumoniae by DNA amplification. J. Infect. Dis., 1990, 162: 984-987.
   12. Rasmussen S.J., Douglas P.P., Тimms P. PCR detection and differentiation of Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci and Chlamydia trachomatis. Mol. Cel. Probes, 1992, 6: 389-394.
   13. Согсish J.D., Вevan B.J. Diagnosis of psittacosis. Vet. Rec., 1991, 12: 42-43.
   14. Hewinsоn R.G., Griffiths P.C., Rankin S.E.S. Towards a differential polymerase chain reaction test for Chlamydia psittaci. Vet. Tec., 1991, 128: 381-382.
   15. Fukushi H., Hiгai K. Proposal of Chlamydia pecorum sp. nov. for Chlamydia strains derived from ruminants. Int. J. Syst. Bact., 1992, 42: 306-308.
   16. Kaltenboeck B.,Kousoulas K.G., Stоrz J. Detection and strain differentiation of Chlamydia psittaci mediated by a two-step polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol., 1991, 29: 1969-1975.
   17. Kaltenboeck B.,Kousoulas K.G., Stоrz J. Two-step polymerase chain reactions and restriction endonuclease analyses detect and differentiate ompA DNA of Chlamydia spp. J. Clin. Microbiol., 1992, 30: 1098-1104.
   18. Kaltenboeck B.,Storz J. Biological properties and genetic analysis of the ompA locus in chlamidiae isolated from swine. Am. J. Vet. Res., 1992, 9: 1482-1487.
   19. Kaltenboeck B.,Kousoulas K.G., Stоrz J. Structures of and allelic diversity and relationships among the major outer membrane protein (ompA) genes of the chlamidial species. J. Bact.,1993, 175: 478-502



Интересное в сети
Это лучшая мыльная основа купить в Москве для мыловарения и ароматы.
 
 
поиск по сайту
 
© 2000-2017 by Oksana&Alexandr Lubenets
программирование - студия дизайна ICOM
 

  Яндекс.Метрика