Форум
главная страница
‹-  Ветеринарные статьи
 
Шуляк Б.Ф.
Лептоспироз
В О З Б У Д И Т Е Л И:
   L.interrogans, L.borgpetersenii, L.kirschneri, L.noguchii, L.santarosai

Таксономия
   Анализ рибосомальной РНК показал родство лептоспир (ЛС) с другими спирохетами, подтвердив тем самым правомерность включения на основании фенотипических свойств рода Leptospira в семейство Spirochaetales порядка Leptospiraceae, относящегося к типу Spirochaetes.
   До 1987г род Leptospira объединял 3 вида ЛС:
1. L.interrogans - патогенные для млекопитающих ЛС, превращающиеся в 1М растворе хлористого натрия при 20-30°C в течение 2 ч в сферические клетки. При температуре 13°C и в присутствии 225 мкг/мл 8-азагуанина не растут.
2. L.biflexa - непатогенные и сапрофитные ЛС, которые не трансформируются в сферические клетки в 1М растворе хлористого натрия при 20-30 °C в течение 2 ч, но растут и размножаются при температуре 13°C и в присутствии 225 мкг/мл 8-азагуанина.
3. L.parva - сапрофиты, обладающие сходными с L.biflexa свойствами, за исключением отсутствия способности расти в присутствии 8-азагуанина.
   Сравнение генома перечисленных видов ЛС с помощью рестрикционного эндонуклеазного анализа хромосомной ДНК (48), гибридизации ДНК с использованием повторяющихся последовательностей (81), риботипирования (84) и ПЦР (88) показало гертерогенность существовавших нозологических единиц и необходимость внесения изменений в таксономию рода Leptospira.
   Прежде всего вид L.parva был перемещен в род Turneria. Таким образом, в настоящее время в роде Leptospira выделяют 12 видов (L.аlexanderi, L.biflexa, L.borgpetersenii, L.fainei, L.inadai, L.interrogans, L.kirshneri, L.meyeri, L.noguchii, L.santarosai, L.weilii, L.wolbachii и 5 геномовидов, обозначаемых цифрами 1-5). Поскольку основанием для их разделения послужили различия генома, то обычно их называют геномовидами.
   На основании различий антигенного состава, выявляемого в реакциях перекрестной агглютинации-лизиса и перекрестной абсорбции антител из антисывороток патогенные виды ЛС делят на серовары, являющиеся основными внутривидовыми таксономическими единицами. Известные в настоящее время 230 сероваров патогенных ЛС разделены на 25 серогрупп (australis, autumnalis, ballum, bataviae, canicola, celledoni, cynopteri, djasiman, grippotyphosa, hebdomadis, icterohaemorrhagiaee, javanica, kirschneri, louisiana, lyme, manhao, mini, panama, pomona, pyrogenes, ranarum, sarmin, sejroe, shermani, tarassovi) (89,127).
   У собак естественную инфекцию вызывают ЛС, относящиеся, по меньшей мере, к 29 сероварам 16 серогрупп 5 видов (табл.16).

Таблица 16
Выделяемые от собак лептоспиры (по 61, 89, 127)
L.borgpetersenii sejroe hardjo
medanensis
saxkoebing
L.interrogans australis australis
bangkok
bratislava
wewak
autumnalis autumnalis
ballum ballum
bataviae bataviae
canicola canicola
djasiman djasiman
hebdomadis kremastos
icterohemmorrhagiae copenhageni
icterohemmorrhagiae
рanama szwajizak
pomona pomona
pyrogenes pyrogenes
ranarum zanoni
robinsoni
L.kirschneri grippotyphosa bulgarica
bim
butembo
grippotyphosa
cynopteri
L.noguchii . panama
L.santarosai . shermani

Морфология
   Вследствии слабого преломления света живые неокрашенные ЛС полупрозрачны. Для их обнаружения вместо световой микроскопии пользуются фазовоконтрастной и темнопольной микроскопией (ПРЛ 10:1.3). При этом агенты имеют вид серебристых спиралевидных нитей с крючковидно-загнутыми концами. Завитки спирали тесно прилегают друг к другу. Она завернута у ЛС всех сероваров вправо (27).





Рисунок 23.
Лептоспира (микроскопирование в темном поле)






   Средняя длина ЛС составляет 7-14 мкм, хотя встречаются и более короткие (3-6 мкм) и более длинные (до 30 мкм) формы. Их диаметр равен 0,07-0,14 мкм, а амплитуда завитков - 0,25 мкм. Даже при увеличении в 400-450 раз эти завитки не заметны, а клетки бактерий кажутся гладко цилиндрическими с загнутыми ввиде крючков концами (рис 23). На последних имеются пуговчатые образования, которые лучше заметны у погибших ЛС. Размер позволяет проходить ЛС через бактериальные фильтры.
   Живые бактерии в жидких средах способны быстро перемещаться (прямолинейно, по кругу или вращением на месте). В полужидких субстратах их движения приобретают змеевидный характер. Периодически они становятся неподвижными, похожими на петлю веревки.
   ЛС проявляют хемотаксис по отношению к веществам с повышенной вязкостью, гемоглобину и т.д. (85). Сахара оказывают противоположный эффект и даже снижают их подвижность (55).


Рисунок 24.
Структура клетки лептоспир.
Обозначения:
1-наружная мембрана;
2-периплазматический цилиндр;
3-жгутик:
- 1-наружная мембрана (а,б,в-ее слои);
- 2-внутренняя мембрана;
- 3-периплазматическое пространство;
4-жгутики;
5-цитозоль

   Структура клеточной стенки ЛС аналогична таковой других спирохет (рис.60). 3-5-слойная наружная мембрана окружает протоплазматический цилиндр, покрытый гибким пептидогликановым слоем, тесно ассоциирванным с внутренней цитоплазматической мембраной, как у грамположительных бактерий. В этих слоях отсутствуют гликолипиды. В пептидогликане преобладает орнитин, а не диаминопимелиновая кислота, как считалось ранее.
   Наружная мембрана ЛС весьма необычна, поскольку является самой жидкой из известных на сегодняшний день. Находящиеся в ней наружные мембранные протеины при движении всегда (даже при изменении направления) смещаются в задний конец клетки. Скорость дрейфа антигенов в мембранах приблизительно составляет 11 мкм/сек (29).
   Оболочка клетки окружает так называемый "протоплазматический цилиндр". Благодаря укорочению закрученных вокруг него осевых нитей последний имеет винтообразную форму.
   Два жгутика (осевые нити) диаметром 20-30 нм локализуются в периплазматическом пространстве между наружной мембраной и пептидогликановым слоем оболочки. Их свободный конец уже внутриклеточного (124). Аксиальная нить состоит из сердцевины диаметром 11,3 мкм, окруженной 2 мембранными слоями толщиной 21,5 и 42 микрон (114). Она прикрепляется крючком к базальному тельцу на противоположном конце периплазматического цилиндра и идет вдоль оси клетки приблизительно до ее центра. Аксиальные нити не перекрываются между собой, как это имеет место у других спирохет (36). Структура базальных телец жгутиков такая же, как и у других грамотрицательных бактерий. Аксиальные нити обеспечивают движение и сохранение ЛС своей формы.
   В культурах ЛС нередко образуют клубки, а по мере старения в них появляются дегенирирующие формы с атипичной морфологией.
   Прохождение на питательных средах более 20 пассажей ведет к изменению морфологии ЛС - увеличению длины и количества завитков спирали, а также уменьшению количества электронно-прозрачных протоплазматических включений. Пассирование измененных изолятов ин виво восстанавливает их морфологию (35).

Антигены
   Антигенный состав ЛС сложен. Наиболее важными антигенами являются протеины и липополисахарид наружной оболочки, жгутика, а также экскреторные антигены.
   Трипсинизация ведет к экстрагированию из ЛС серовароспецифического антигена, состоящего из протеина (4,2 мг/мл), карбогидрата (0,39 мг/мл) и гексозамина (0,025 мг/мл). Этот антиген инактивируется при 80?С за 10 мин (87).
   Обработка тиомерсалом и прогревание при 50-56 ?C не оказывают существенного влияния на антигенные свойства ЛС. При более высокой температуре (80-100?C) экстрагируются высокомолекулярные компоненты. При 121?C, а также при обработке фенолом и формалином антигенная структура бактерий разрушается (86).
   При изменениии окружающих условий, в частности температуры (в процессе перехода из внешней среды в организм хозяина или при культивировании ин витро) у ЛС меняется синтез ряда протеинов цитоплазмы, периплазмы и наружной мембраны. Особенно вариабельными являются антигены наружной мембраны.

Наружная оболочка
   В поверхностной мембране патогенных ЛС обнаружено 7 протеинов с мМас от 77 до 16 кД. Поверхностные протеины с мМас 66, 32, 45, 40 и 22 кД иммунологически идентичны у патогенных сероваров ЛС (10, 14).
   Мажорный поверхностный липопротеин с мМас 32 кД термолабилен, высокоиммуногенен и видоспецифичен. Он разрушается ферментом клострипаном на 2 фрагмента с мМас 21 и 24 кД, состоящих из 5 и 19 аминокислотных остатков, соответственно (10). Протеин с мМас 66 кД занимает субповерхностное положение (14).
   Липополисахарид ЛС биохимически напоминает таковой грамотрицательных бактерий, но отличается очень низким содержанием жирных кислот (менее 2%). Входящий в состав липополисахарида олигосахарид состоит из рамнозы, арабинозы, рибозы, фукозы, глюкозы, маннозы, глюкозамина, глюкуроновой кислоты и 2-кето-3-дезоксиоктоновой кислоты (116). Обработка 0,1N гидроокисью натрия ведет к отщеплению от молекулы липополисахарида карбогидратного антигена с мМас 4 кД. Оба фрагмента являются мажорными антигенами и протективными иммуногенами ЛС (115). С антигенной реактогенностью липополисахарида связаны серогруппо- и серовароспецифические свойства: у сероваров grippotyphosa и icterohaemorrhagiaee он реагирует в ЭЛИЗА только с гомологичными сыворотками, а у сероваров copenhageni, canicola и pomona дает перекрестные реакции с антисыворотками к другим сероварам (30).
   Липополисахарид ЛС не пирогенен и не индуцирует у животных местную реакцию Шварцмана, но проявляет ряд других свойств липополисахаридов - токсичность, способность активировать комплемент и стимулировать митогенез лимфоцитов. Токсичность липополисахарида не высока, но ее можно выявить в культуре клеток (32).
   В состав наружной мембраны ЛС в отличии от других спирохет входят 3 липопротеина. Гликолипопротеин экстрагируется из ЛС смесью хлороформа, метилового спирта и воды, взятых в соотношении 1:2:0,8. Он представляет собой гидрофильную молекулу с карбогидратной цепью, содержащей аминогруппы. Проявляет серовароспецифическую реактивность и способен индуцировать протективный иммунитет (65). Гликолипопротеин ингибирует Na+K+ATФ-азу. Такая активность связана с адсорбированными на нем олеевой и пальмитолееовой кислот (26). В состав гликолипопопротеина вирулентных изолятов входит белок с мМас 30кД, а у аттенуированных штаммов вместо него экспрессируется белок с мМас 20 кД (41). Ферменты расщепляют этот белок на фракции размером 14-66 кД. Фракция с мМас 24 кД содержит серовароспецифический эпитоп (83).
   Помимо него у ЛС обнаруживают липопопротеины с мМас 41 и 36 кД. Последний не связан непосредственно с наружной мембраной, а локализуется в периплазматическом пространстве. Он интенсивно экспрессируется в основном ин витро (16), а при температуре 37?C его синтез полностью прекращается. На второй липопоротеин с мМас 41 кД температурный фактор не оказывает существенного влияния (74).
   В наружной оболочке обнаружены и другие, менее изученные протеины, в частности имеющие мМас 77 и 18 кД (77).

Внутренняя оболочка
   Пептидогликан ЛС отличается от такового других спирохет отсутствием в своем составе гликолипидов, а также преобладанием диаминопимеликовой кислоты над орнитином. Он индуцирует адгезию нейтрофилов к эндотелиальным клеткам, что является первым этапом их миграции из кровеносного русла в ткани (32).
   Важнейшими компонентами внутренней оболочки ЛС являются 2 группы ферментов, проявляющих активность транспептидаз и D-аланин карбоксипептидаз. Их нуклеотидная последовательность у разных сероваров имеет незначительные различия, а степень гомологии с аналогичными белками E.coli составляет 50%. За способность связывать пенициллин их назвали "пенициллинсвязывающими протеинами" (41). Они играют важную роль в биосинтезе пептидогликана. неодинаковы. Пенициллинсвязывающие протеины ЛС имеюм мМас равную 20, 32, 41-59, 64 и 82-89 (димер) кД. У разных сероваров ЛС их набор и мМас не одинаковы (23).

Жгутиковые антигены
   Несмотря на своеобразное положение жгутиков (в периплазматическом пространстве между наружной и внутренними мембранами), их антигены высокоиммуногенны. В сыворотке крови больных лептоспирозом людей и животных выявляют высокие титры антител к этим белкам, а антисыворотка к ним агглютинирует цельные клетки бактерий (40). Их делят на 2 класса: класс А ассоциирован с оболочкой жгутика, а класс В с его сердцевиной.
   Электрофорез выявил 3 мажорных протеина жгутика, имеющих мМас 31, 35 и 33+34 (димер) кД, а также несколько минорных протеинов с мМас от 30 до 67 кД. Сравнение в иммуноблоттинге показало, что жгутиковые протеины с мМас 30-40 кД являются общими для разных сероваров, а жгутиковые антигены с мМас 20-30 кД - серовароспецифичны.
   Мажорный протеин сердцевины жгутика FlaB, имеющий мМас 35 кД, состоит из 283 аминокислотных остатков. Его изоэлектрическая точка равна 9,065 (63). Флагелин FlaB у разных сероваров патогенных ЛС проявляет высокую степень гомологии в N- и C-терминальных участках, в то время, как центарльная часть его молекулы весьма вариабельна (26).
   Почти такую же мМас (34 кД) имеет протеин, который образует окружающую жгутик мембрану. Аминокислотная последовательность обоих белков ЛС разных сероваров идентична (114).

Тинкториальные свойства
   ЛС плохо окрашиваются по Граму и анилиновыми красителями. По этой причине, а также из-за морфологических изменений и утраты подвижности, происходящих во время фиксации и окрашивания мазков, окрашивание ЛС в рутинной диагностической работе проводят редко.
   Тем не менее, при необходимости с этой целью пользуются методами Романовского с предварительной фиксацией осмиевой кислотой (бледно-розовое окрашивание), Киктенко (красно-фиолетовое окрашивание), Фонтана (темно-коричневое окрашивание) или импрегнации серебром по Вартин-Старри (коричнево-черный цвет) (ПРЛ 10:1.1,1.2 ; 14:1.1; 15:2.1).
   Анализ тинкториальных свойств с учетом приведенных выше данных о структуре бактериальной клетки не позволяют отнести ЛС к грамположительным или грамотрицательным бактериям - их правомерно считать переходным типом бактерий.

Биохимические свойства
   ЛС - хемоорганотрофы с дыхательным типом метаболизма. Повышенная чувствительность к солям синильной кислоты, а также результаты спектроскопических исследований свидетельствуют об участии в их дыхании цитохромной системы. Они оксидазонегативны, но каталазо- и/или пероксидазопозитивны.
   Эти микроорганизмы проявляют выраженную аминопептидазную активность при отсутствии протеолитических свойств (76). По механизмам синтеза изолейцина разные ЛС различаются, что дает основание для разделения их на 3 класса (121). Микроорганизмы класса 1 осуществляют это обычным треониновым путем, представители класса 3 - уникальным (пируватным) способом, а остальные ЛС, вошедшие в класс 2, обоими способами.
   ЛС способны утилизировать азот из мочевины, креатинина и саркозина, что протекает под контролем ферментов микроорганизмов - аланин дегидрогеназы, глютамат дегидрогеназы и глютамат пируват трансаминазы.
   В клетках ЛС обнаружены следующие липидные компоненты: свободные жирные кислоты (41,8%), мажорный фосфолипид (14,8%), фосфатидилэтаноламин (12,9%), эфир холестерина (CE) (9,3%), липофосфатидилэтаноламин (4,9%) и дифосфатидилглицерин (1,1%). Свободные жирные кислоты представлены гексадеканоиковой (26,9%), гексадеценоиковой (15,4%), октадеценоиковой (26,5%) и октадекадиеноиковой (27,4%) кислотами. В состав мажорного фосфолипида входят тетрадекадиеноиковая (53,6%), тетрадекатриеноиковая (14,0%) и октадектадеканоиковая (13,8%) жирные кислоты. Фосфолипид с полиненасыщенными жирными кислотами и 14 атомами углерода в молекуле выявлен только у вирулентных штаммов и отсутствует у авирулентных (71).

Культивирование
   Патогенные ЛС являются аэробными (часто микроаэрофильными) спирохетами. Ин витро при хорошей аэрации, pH 7,2-7,4 и оптимальных условиях инкубирования (температуре 28-30°C для большей части сероваров и 30-32°С для L.canicola) они культивируются намного лучше, чем другие спирохеты. Границы температуры инкубации посевов, в пределах которых возможен рост ЛС, составляют 22-37°С.
   Для нормального роста они нуждаются в липидах и ненасыщенных жирных кислотах, а также витаминах В1 и В12 (33). Наличие белка в питательной среде для ЛС не обязательно. Из числа аминокислот только аспарагин оказывает на них стимулирующее действие (20). Его можно заменить полисорбатами. Обработка твина поливинилпирролидоном устраняет его токсичность для ЛС. В средах без протеина, но с обработанным этим способом твином урожай ЛС достигает 108 кл/мл (97). Неплохой альтернативой твину-80 является пируват натрия, который добавляют в среды в концентрации 100 мкг/мл (113). Наличие в субстрате сахаров угнетает их рост (7).
   Наиболее интенсивно ЛС растут на жидких и полужидких питательных средах с 5-10% сыворотки крови кролика или барана (вместо сыворотки часто применяют сывороточный альбумин). Время развития одной генерации ЛС в логарифмической фазе составляет 58-68 ч, поэтому максимальный рост наблюдают на 5-10 дн.
   Классической питательной средой для ЛС является среда Ногуши-Веньона. Наибольшее распространение в работе с ними получили жидкие (Уленгута, Ферворта-Вольфа в модификации Тарасова, Кортхофа и др.) и полужидкие (Флетчера и др.) агаровые среды (ПРЛ 10:2).
   На жидких средах эти спирохеты растут медленно - максимальный урожай бактерий обычно получают на 5-10 дн культивирования. При микроскопировании препаратов культур в этот период в одном поле зрения (окуляр х10, объектив х40) обычно обнаруживают около 100 подвижных бактерий. Культуры ЛС в жидких средах бесцветны, не имеют запаха, при бурном росте опалесцируют. Опалесценция лучше видна в проходящем свете при легком встряхивании пробирки.
   В полужидких средах на 1,5-2 см ниже поверхности появляется помутнение ввиде кольца, интенсивность которого усиливается по мере роста ЛС. В средах с 1% агара эти бактерии формируют преимущественно заглубленные колонии, контуры которых могут быть четкими или размытыми. Тенденция к заглубленному росту (феномен Дингера), обеспечивающая некоторое ограничение доступа кислорода, свидетельствует о микроаэрофильности ЛС.
   В средах с 2% агара ЛС образуют поверхностные колонии, имеющие разную степень прозрачности вплоть до трудно различимых при обычном освещении. Пассирование изолятов ин виво повышает частоту образования такого типа колоний, в то время, как многократные пересевы ин витро способствуют усилению заглубленного роста (122). Чем чаще делают пересевы, тем быстрее получают пышный рост культур.
   Фосфомицин (400 мкг/мл) в сочетании с 5-флуорацилом (100 мкг/мл) при добавлении в среду ингибируют размножение посторонней микрофлоры, не влияя на рост ЛС. Это позволяет использовать их в селективных средах (79). В качестве селективных компонентов сред применяют также мочевину, соли кобальта и антимикробные препараты (неомицин, рифампицин, фурацилин, фурагин, налидиксовую кислоту, комбинации рифампицина, полимиксина В, бацитрацина и актидиона (52, 79).
   В процессе хранении музейных штаммов ЛС их пересевают не реже 1 раза в месяц. Для длительного хранения культуры заливают слоем стерильного вазелинового масла или запаивают в ампулы, что предупреждает испарение среды и изменение ее рН.
   Патогенные ЛС в процессе культивирования ин витро постепенно утрачивают свою вирулентность. Последнюю часто удается восстановить посредством заражения чувствительных животных, например, молодых морских свинок (36).

Геном
   Геном L.interrogans имеет размер около 3,85-5,45 млн пар оснований и состоит из 2 соединенных между собой циркулярных репликонов - хромосомы и плазмиды pLIN1, имеющих размер в 3,5-5,1 и 0,35 млн пар оснований, соответственно. Он характеризуется низким (34-41%) суммарным содержанием гуанина и цитозина (130).
   На хромосоме расположена большая часть генов, причем гены рРНК широко разбросаны (15). Гибридизация генома ЛС показала наличие в нем по паре генов 23S и 16S и 1 гена 5S рРНК, расположенных в удалении друг от друга (39)
   Плазмида содержит ген asd, кодирующий аспартат ?-семиальдегид дегидрогеназу - фермент, отвечающий за биосинтез аминокислот и формирование клеточной стенки (130).
   Гены ponA и pbpB кодируют синтез пенициллинсвязывающих протеинов (23)

Устойчивость
   Патогенные серовары ЛС чувствительны к повышенной температуре (при 45?С они погибают в воде за 45 мин, при 56°С за 30 мин и при 70?С менее, чем за 1 мин). Низкую температуру (даже замораживание), а также защелачивание среды вплоть до рН 9,8 они переносят хорошо. При рН10 бактерии необратимо утрачивают подвижность. Кислая среда для них губительна. Например, в кислой почве (рН 5,5) ЛС сохраняются до 6 нед, но при этом их титр снижается приблизительно в 2500 раз (46). В тоже время в земле с рН 6,7-7,2 и влажностью 15,2-31,4% они выживают на протяжении 2,5 мес (4).
   При воздействии прямых солнечных лучей ЛС погибают за 30-120 мин. Высушивание также действует на них губительно.
   На сохранение патогенных ЛС в почве и других естественных субстратах влияет не только рН, но и целый комплекс других факторов, в т.ч. влажность, интенсивность инсоляции и температура. В пресноводных водоемах срок сохранения жизнеспособности этими бактериями варьирует от нескольких часов до 1 мес, в сухой почве не превышает 2-3 ч, а в заболоченной возрастает до 7 мес (4).
   На продолжительность сохранения возбудителя в воде большое влияние оказывает ее соленость. Поэтому в пресноводном водоеме, болоте или обычной луже ЛС длительнее сохраняют свою жизнеспособность, чем в лимане или море.
   В жидком азоте вирулентность и жизнеспособность ЛС не меняется при наличии в криопротекторе 2,5% диметилсульфоксида. Глицерин проявляет по отношению к ним в 10 раз большую токсичность, чем диметилсульфоксид (82).
   Патогенные ЛС устойчивы к 5'-фторурацилу и фосфомицину, оказывающим ингибирующее действие на сапрофитных представителей рода (79).
   Ин витро ЛС проявляют высокую чувствительность к большинству используемых практическими ветеринарными врачами антибиотикам, в т.ч. к стрептомицину, левомицетину, тетрациклинам, фторхинолонам (байтрилу, флоксацину, ципрофлоксацину, тосуфлоксацину), макролидам (эритромицину и йозамицину) и лактамовым антибиотикам (17, 90, 105). МИК ампициллина для них равна 0,025-0,78 мкг/мл, пенициллина G - 0,39-3,13 мкг/мл, а бактерицидная концентрация этих антибиотиков составляет <25 и 100 мкг/мл, соответственно (23). Минимальная ингибирующая концентрация фторхинолонов приблизительно соответствует таковой тетрациклиновых антибиотиков (106), а минимальная лептоспироцидная концентрация составляет около 0,6 мкг/мл (99). Исключение составляют хлорамфеникол и рифампицин, к которым ЛС резистентны.
   Эти микроорганизмы довольно быстро инактивируются обычно применяемыми дезинфектантами: 0,25% раствором формалина за 5 мин, 0,5% раствором едкого натрия - за 10 мин, 1% раствором карболовой кислоты за 30 мин. ЛС погибают при давлении 2 кбар в течение 1ч (100).


Э П И З О О Т О Л О Г И Я

Распространение
   Патогенные для собак ЛС распространены повсеместно в разнообразных климато-географических зонах.
   На протяжении, по крайней мере, последних 2 веков роль основного возбудителя желтушной формы болезни у собак играл серовар ichterohaemorrhagi, а бeзжелтушного лептоспироза - серовар canicola. Наряду с ними в популяции собак в США циркулируют серовары bratislava, pomona и grippotyphosa (11, 24, 78), в Бразилии впервые у собак выявлены антитела к серовару butembo и pyrogenes (42, 94), в Европе - grippotyphosa, bratislava, pomona, saxkoebing, sejroe, hardjo, poi и ballum (22, 45, 101, 110), на Барбадосе - bim и grippotyphosa (53, 119), в ЮАР - tarassovi и pyrogens (73). Перечень видов и сероваров ЛС, когда-либо изолированных от собак, приведен в таблице 40.
   В связи с происходящим в настояшее время интенсивным перемещением собак не только по территории отдельных государств, но и за их границы возрастает риск распространения патогенных для собак сероваров ЛС в географических районах, где они раньше не встречались. Существующие лептоспирозные вакцины для этого вида животных и правила ввоза домашних животных, принятые в разных странах, не в состоянии решить эту проблему.
   Помимо географического фактора на широту распространения сероваров ЛС оказывают влияние и другие факторы. В последнее десятилетие в США в связи с регулярным проведением вакцинации собак препаратами, приготовленными из сероваров canicola и ichterohaemorrhagi, отмечается постепенное вытеснение этих сероваров сероварами pomona, grippotyphosa и autumnalis (44, 92). На Барбадосе, в Австралии и Новой Зеландии в популяции собак ранее также доминировали серовары сanicola и icterohaemorrhagiaee, которые в настоящее время практически не встречается, зато доминируют серовары australis, аutumnalis, рomona (119), copenhageni (49) и крайне редко tarassovi and pomona (64). Во Франции участились случаи лептоспирозного гепатита, вызываемого сероваром аustralis (8).
   Уровень серопозитивности бродячих собак, являющихся основной группой риска, варьирует в широких пределах, нередко превышая 38-60% (38, 454, 110). Этот показатель следует рассатривать как объективный индикатор широты рспространения сероваров ЛС в очагах инфекции.

Резервуар инфекции
   Резервуар инфекции сформирован большим количеством домашних, синантропных и диких животных, неполный перечень которых представлен в таблице 17.


Таблица 17
Резервуар ряда патогенных для собак лептоспир (по 57)
Серовары Дополнительный резервуар
Домашние и синантропные животные Дикие животные
Australis крыса, мышь сумчатые
Autumnalis корова, мышь, крыса енот, опоссум
Ballum мышь, крыса нд
Bataviae корова, крыса, мышь, крыса еж, броненосец, землеройка, крот
Bratislava свинья, лошадь, корова, крыса, мышь енот, опоссум, лиса, скунс
Canicola корова, овца, лошадь, свинья, крыса енот, еж, броненосец, мангуст, скунс, крот
Grippotyphosa корова, свинья, овца, коза, кролик, мышь, крыса крот, енот, скунс, опоссум, лиса, белка, рысь, емлеройка, еж, мускусная крыса, ласка
Hardjo корова, свинья, лошадь, овца дикие жвачные
Icterohaemorrhagiaee и Сopenhageni корова, лошадь, свинья, крыса, мышь енот, опоссум, лиса, еж, ондатра, скунс, цивета, обезьяна
Javanica крыса .
Pomona корова, свинья, мышь, лошадь олень, енот, опоссум, еж, лиса, крот
Shermani буйвол нд
Обозначения: нд- нет данных

   Несмотря на то, что одни и те же виды животных могут быть инфицированы разными сероварами микроорганизма, все-таки отмечается определенный тропизм последних. Весьма условно виды животных, широта распространения в которых определенного серовара ЛС шире, чем у других хозяев, называют доминирующим или первичным резервуарным хозяином. Таковым для сероваров icterohaemorrhagiaee и сopenhageni является крыса, для серовара grippotyphosa - мышь-полевка, для серовара canicola - собака, для серовара hardjo - жвачные, для серовара pomona - свинья и корова. Собака выполняет роль доминирующего резервуарного хозяина сероваров canicola и bataviae (28). Первый из названных сероваров циркулирует также в популяциях крысы, крота, ежа, енота, скунса, мангуста, броненосца, крс, лошади и свиньи, а второй - ежа, крота, землеройки, броненосца и крс. В отношении других сероваров собака является не основным, а случайным хозяином.
   Грызуны служат постоянным компонентом природного резервуара большей части патогенных для собак сероваров L.interrogans. Участие этих синантропных животных в поддержании и распространении инфекции определяет многие эпизоотические аспекты лептоспирозной инфекции. Ее регистрируют повсеместно, особенно в сельских районах, а также в городских кварталах вблизи от продовольственных магазинов, овощехранилищ, мясокомбинатов и других предприятий, где имеется большая популяция грызунов. Для мышей и особенно крыс характерны высокий уровень инфицированности и длительное (нередко пожизненное) лептоспироносительство. У большей части грызунов инфекция протекает безсимптомно, но при этом ЛС размножаются в почках и выделяются во внешнюю среду с мочой.
   Длительное бессимптомное лептоспироносительство, сопровождающееся выделением возбудителя из организма во внешнюю среду (особенно с мочой) присуще не только грызунам, но и собаками, а также другим видам животных. Этот феномен, по всей вероятности, играет ключевую роль в сохранении патогенных сероваров ЛС в неблагополучном по инфекции очаге и распространении инфекции за пределы последнего. Моча, содержащая возбудителя, контаминирует почву, водоемы, окружающие предметы и служит источником заражения. Для собак такой путь распространения инфекции особенно актуален, т.к. базируется на их врожденном рефлексе метить "свою территорию" мочой и регулярно "читать" чужие метки.
   Контаминация объектов внешней среды ЛС возможна не только описанным выше путем, но и через фекалии, поскольку эти бактерии регулярно попадают из печени в кишечник с желчью (6).
   Человек не служит источником инфекции для собаки, поскольку, как правило, из его организма в окружающую среду не происходит длительного выделения возбудителя. Этому способствуют также меры гигиены и кислая рН мочи людей.

Восприимчивость
   К лептоспирозной инфекции восприимчивы собаки обоего пола всех пород. Несколько чаще заражаются кобели, но это, по всей вероятности, связано с облизыванием ими половых органов сук (45).
   Безжелтушной формой лептоспироза чаще болеют взрослые собаки в возрасте старше 2 лет. Желтушная форма болезни может развиваться у собак всех возрастов, но ее инцидентность наиболее высока среди молодых собак и щенков (45).

Цикличность
   Лептоспироз собак имеет спорадическое проявление в течение всего года с максимальной инцидентностью в странах Восточной Европы с мая по ноябрь. Существуют несколько объяснений сезонности заболеваемости лептоспирозом этого вида животных. Первостепенную роль играет динамика активизации и роста популяции грызунов, являющихся основным компонентом природного резервуара ЛС. В указанные периоды года выпадает наибольшее количество осадков, а во влажной почве ЛС выживают значительно лучше, чем в сухой. В период с весны по осень ("дачный" сезон) значительно больше городских собак попадает в сельскую месность, и возможность контакта с инфицированными ЛС синантропными и дикими животными возрастает. В еще большей мере это относится к охотничьим собакам. Кроме того, в теплое время года собаки часто купаются в водоемах с непроточной водой, в которой ЛС могут очень долго сохранять жизнеспособность. В дождливые годы инцидентность "летнего" лептоспироза закономерно повышается по сравнению с засушливыми. При низкой влажности и высокой температуре, а также в холодное время года (зимой) ЛС погибают значительно быстрее.
   Описанные закономерности зависимости инцидентности лептоспироза в большей степени присущи его безжелтушной форме. Желтушным лептоспирозом собаки могут заболеть в течение всего года при менее выраженной, чем при безжелтушной форме болезни, росте инцидентности весной и осенью (45).
   Вследствии низкой контагиозности ЛС вспышки болезни носят циклично-энзоотический характер. В питомниках собак в первые 1-2 нед вспышки заболевает большое количество животных, а затем в течение приблизительно такого же времени инцидентность болезни резко снижается, чтобы в конце этого периода снова резко возрасти. В городских условиях лептоспирозная инфекция собак обычно носит спорадический характер. Однако в определенные годы в городах с высокой концентрацией собак и грызунов происходят вспышки лептоспироза, сопровождающиеся высокой заболеваемостью, как это например, имело место в 1898 г в Штутгардте (Германия).

Пути заражения
   Заражение собак происходит в основном горизонтальным путем - через пищеварительный тракт при приеме корма и воды, контаминированных ЛС, аэрозольно и, реже половым путем. Возможно также и вертикальное распространение инфекции от инфицированной суки - через плаценту плодам и через молоко подсосным щенкам. ЛС могут проникать в организм не только через слизистые оболочки, но и через поврежденную кожу.
   Векторная роль насекомых (блох, клещей и мух) при лептоспирозе изучена недостаточно, хотя Кумерту и Шмидтке установили, что ЛС сохраняют свою жизнеспособность в кишечнике мух по меньшей мере 26 ч (3).


П А Т О Г Е Н Е З

Факторы вирулентности
   К факторам вирулентности ЛС следует отнести их подвижность, адгезивность, инвазивность, липополисахарид и ферменты.

Подвижность
   Подвижность ЛС играет важнейшую роль в их диссеминации по организму, в т.ч. в процессе проникновения в ткани, без чего невозможно развитие инфекции и заболевания. У патогенных ЛС выявлен хемотаксис по отношению к гемоглобину (126).

Адгезивность
   Между вирулентностью и степенью адгезивности ЛС к клеткам-эукариотам имеется прямая зависимость, хотя механизмы адгезии точно не определены (129). Адгезивные свойства проявляют в основном наружные мембранные протеины, прикрепляющиеся к фибронектину и коллагену клеток хозяина. Одним из таких адгезинов является обнаруженный только у серовара icterohaemorrhagiaee фибронектинсвязывающий протеин наружной мембраны с мМас 36 кД (68).

Ферментативная активность
   Распространению в тканях и защите от фагоцитов способствуют ферменты ЛС, из которых наиболее изучены фосфолипазы и гемолизины.
   - Фосфолипазы
   Вирулентные штаммы обладают большей в 3-4 раза активностью фосфолипаз А и С, чем непатогенные и сапрорфитные ЛС. Активность этих ферментов можно установить по величине зоны просветления в сывороточно-лецитиновом агаре (5).
   - Гемолизины
   ЛС обладают 2 гемолитическими протеинами - сфингомиелиназой С и гемолиз-ассоциированным протеином 1 (hap-1). Оба гемолизина наиболее активны при рН 8,1 (19). Сфингиомиелиназа С термостабильна, имеет мМас 41 кД и проявляет большое сходство с ?-гемолизином S.aureus и сфингомиелиназой С Bac.cereus (98). Индуцированный ею гемолиз обусловлен образованием в плазмалемме эритроцитов пор. Оба гемолизина отличаются высокой консервативностью для разных сероваров L.interrogans и отсутствуют у непатогенных ЛС (60). Патогенные серовары различаются по интенсивности гемолитических свойств и их спектру (т.е.на эритроциты каких видов животных оно направлено) (46). В процессе гемолиза эритроциты трансформируются в сфероцисты, а затем их плазмалемма инвагинируется (125). В безсывороточной среде ЛС образуют гемолизин только в присутствии гемина. Замена гемина другими порфиринами или цитохромом С ведет к прекращению экспрессии бактериями гемолизинов (59). Гемолизины появляются в надосадочной жидкости культуры ЛС, выращиваемой на жидкой безсывороточной среде, в конце логарифмической фазы роста. Они достигают "плато" на 11-14 дн культивирования.
   Гемолитическая активность инактивируется дикалий этилендиаминтетрауксусной кислотой, но в последующем она может быть восстановлена добавлением ионов Mg2+. Плазма крови ингибирует гемолитические свойства ЛС (112). Ингибирующее действие связано с ее фракцией, экстрагированной хлороформом и метиловым спиртом.
   У L.interrogans обнаружены и выделены в чистом виде гемолизин и сфингомиелина С.

Токсины

Эндотоксин
   Свойства эндотоксина ЛС ассоциированы с липидом А. Будучи составной частью липополисахарида, он проявляет свою активность в комплексе с остальными компонентами молекулы последнего. Поэтому здесь мы приводим описание не только самого эндотоксина, как фактора вирулентности, но и других частей этого комплекса.
   Липид А индуцирует тромбоцитопению и агрегацию тромбоцитов, что ведет к нарушениям свертываемости крови и запускает механизмы диссеминированной внутрисосудистой коагуляции. Он оказывет токсическое действие на моноциты. Внутривенное введение липополисахарида ведет к его накоплению в печени, селезенке и лимфатических узлах с последующим развитием в этих органах некротических процессов (51).
   В состав олигосахаридного компонента входит рамноза и 4-О-метилманноза в соотношеннии 3:5:1 (66). С 1 из них ассоциирована серовароспецифичная детерминанта (80). Олигосахарид ингибирует связывание ЛС опсонизирующих и агглютинирующих антител к липополисахариду (69). Рост ЛС в среде с дифениламином ведет к уменьшению содержания в их клетках липополисахарида и резистентности бактерий к лептоспироцидному действию антител и комплемента, а также фагоцитированию. ЛС с пониженной экспрессией липополисахарида быстро элиминируются из организма животных (50).
   Липополисахарид ЛС стимулирует секрецию интерлейкина-1 и интерферона (51). Совместно с липопротеинами наружной мембраны ЛС он активирует макрофаги через их CD14 и Toll-подобный рецептор 2 (TLR2). TLR4, являющийся главным рецептором макрофагов для грамотрицательных бактерий, в распознавании ЛС не участвует (120).

Инвазивность
   Патогенные ЛС, в отличии от непатогенных, способны выживать, будучи захваченными фагоцитами. На модели культур клеток (перевиваемой линии почки мартышки Vero и моноцито-макрофагальной линии J774A.1) установлено, что L.interrogans активно участвует в инвазионном процессе. Поскольку монодансилкадаверин ингибирует, а цитохолазина D не влияет на инвазивные свойства ЛС, то предполагается, что в основе данного процесса лежит эндоцитоз бактерий через специфические участки плазмалеммы атакованных ими клеток без участия микрофиламентозной системы последних (67). Процесс инвазии клеток ЛС не сопровождается повреждением плазмалеммы последних, как это предполагалось ранее (117).
   Внутриклеточная локализация позволяет ЛС избегать воздействия факторов иммунитета и антимикробных препаратов. Кроме того, локализуясь в цитоплазме макрофагов, они индуцируют фрагментацию ДНК, запуская механизмы апоптоза (67).

Механизмы патогенеза
   ЛС проникают в организм собаки через слизистую оболочку или поврежденную кожу. В воротах инфекции обычно не развивается специфических поражений. Из них возбудитель в последующие 4-11дн проникает в кровь, вызывая септицемию. Клинически лептоспиремия проявляется лихорадкой, кратковременной гемолитической анемией, лейкоцитозом, гемоглобинурией и альбуминурией.
   Продолжительность бактериемии благодаря усиливающемуся иммунному ответу обычно составляет 4-5 дн. Элиминация бактерий из крови сопровождается прекращением лихорадки. Во время септицемии ЛС разносятся кровью по всему организму, проявляя при этом (в зависимости от серовара) более или менее выраженный тропизм к печени, почкам, плаценте и плодам.
   Благодаря высокой подвижности и небольшой толщине они избегают фагоцитоза ретикулоэндотелиальными клетками печени и проникают через эндотелиальную выстилку синусоидов, достигая пространства между клетками паренхимы (70). В печени эти сприрохеты активно размножаются, вызывая паренхиматозное воспаление с последующим включением основных патогенетических механизмов гепатита, в т.ч. характерной для этой формы лептоспироза желтухи. Поражения печени вызваны механическим повреждением гепатоцитов ЛС, а также действием их токсинов. Помимо нарушения динамики оттока из воспаленной печени желчи определенную роль в патогенезе желтухи играет диссеминированный геморрагический процесс, происходящий в результате воздействия на эритроциты гемолизинов возбудителя.
   L.canicola и другие безжелтушные серовары ЛС проявляют наибольший тропизм к паренхиме почек. При интенсивной инвазии тканей, сопровождающейся повреждением эндотелиальных и паренхиматозных клеток в почках, так же, как и при инфекции желтушных сероваров ЛС, в печени появляются геморрагические и некротические очаги. Однако в большинстве случаев инфекция носит менее острый характер и ведет к развитию у собак хронического очагового интерстициального нефрита и нефроза, сопровождающихся гемоглобинурией. Такие поражения могут стать причиной почечной недостаточности, нередко приводящей к летальному исходу.
ЛС механически повреждают эндотелиальную выстилку кровеносных сосудов, что повышает проницаемость последних и ведет к многочисленным кровоизлияниям в органах и тканях.
Неврологические явления, иногда сопровождающие болезнь, могут быть обусловлены рядом факторов, в т.ч. действием на ЦНС продуктов метаболизма и распада агента, гепато-энцефалическим синдромом, а также локальным размножением ЛС, занесенных кровью в ЦНС.
Нарушение электролитического балланса при лептоспирозе вероятно связано с ингибицией Na+K+АТФазы, которая вызывается гликолипопротеиновой фракцией патогенных ЛС (26).
Характер и тяжесть поражений органов и тканей при заболевании зависит от серовара возбудителя и его вирулентности, а также иммунного состояния собаки. У привитых собак в зависимости от напряженности иммунитета инфекция либо элиминируется, либо протекает в более легкой форме, чем у непривитых животных. Однако это происходит только в том случае, если вакцина и вызвавший инфекцию полевой штамм ЛС относятся к одному или близким в антигенном плане сероварам.
Гуморальный иммунный ответ постепенно вытесняет возбудителя из тканей инфицированного животного, за исключением проксимальных канальцев почек, головного мозга, передней камеры глаз и органов воспроизводства, в которых ЛС сохраняются и даже могут медленно размножаться. Такие очаги инфекции в организме обусловливают феномен носительства и, как можно предположить, в отдельных случаях становятся причиной рецидивов болезни.
Рецидивы лептоспироза обычно возникают на фоне снижения титра сывороточных антител к ЛС, закономерно происходящего после клинического выздоровления животного. По той же причине возбудитель может выделяться на фоне отсутствия клинических проявлений инфекции и состояния серонегативности.
Инвазивность вирулентных ЛС в культурах клеток значительно ингибируется монодансилкадаверином, что свидетельствует о том, что их проникновение в клетки происходит посредством эндоцитоза в области соответствующих рецепторов (67).
Основными мишенями для возбудителей желтушного лептоспироза являются печень и почки, причем именно поражения последних являются наиболее частой причиной гибели заболевших собак. Характер патологогистологических изменений, выявляемых у павших от лептоспироза животных, наталкивает на предположение об участии в их патогенезе факторов иммунитета. Эта гипотеза подтверждается выявлением положительной корреляции тяжести поражений почек на поздней стадии развития болезни и уровня гуморального иммунного ответа, а также низкой результативностью антибиотикотерапии в этот период.
   Относительно способности ЛС персистировать в клетках (в частности эндотелии почечных канальцев) нет единого мнения, хотя такая возможность спасения возбудителя от воздействия факторов иммунитета хозяина не исключается.


СИМПТОМАТИКА
   Лептоспироз собак может протекать безсимптомно или проявляться клинически в желтушной или безжелтушной формах. Их тяжесть зависит от возраста и иммунного статуса инфицированного животного, вирулентности вызвашего инфекцию серовара ЛС, заражающей дозы и пути заражения.
   При типичном течении лептоспироз имеет 2-фазный характер: вначале развивается симптоматика, связанная с бактериемией, а на второй фазе на первый план выступают клинические признаки поражения определенных органов.
   В подострых случаях собака может переболевать без появления характерной симптоматики. При таком течении инфекции у заболевшей собаки снижается аппетит, развивается субфебрильная температурная реакция (38,5-40?C), появляются мышечные боли, слабость, угнетение, иногда конъюнктивит, признаки анемии, а также клинические признаки описанных ниже желтушной или безжелтушной форм лептоспироза, но в стертом виде.
   При обеих формах болезни у щенных сук инфекция может вызвать аборт (28).
   При лептоспирозе у собак выявляют ряд гематологических изменений: анемию средней тяжести, лейкопению (на лептоспиремийной стадии инфекции), которая сменяется лейкоцитозом со сдвигом влево, тромбоцитопению, гипербиллирубинемию (3-50 мг/дцл), гиперазотемию, гиперкреатинемию (3-20 мг/дцл), гиперфосфатемию, а также повышение концентрации амилазы и липазы. Увеличение активности в сыворотке крови печеночных ферментов (аланинтрансферазы и аспартаттрансферазы ), а также при тяжелом поражении почек и/или печени - повышение концентрации в крови азота мочевины и креатинина свыше 25 и 2 мг/дцл, соответственно (58).

Безжелтушный лептоспироз
   Классическим примером этой формы болезни является геморрагический энтерит или тиф собак, впервые описанный в 1850 г Хофером. Спустя 48 лет эта болезнь стала причиной потери большого количества собак в немецком городе Штутгардте, где она получила новое название - штутгартская болезнь. Ее возбудителем оказался серовар L.canicola.
   Инкубационный период инфекции колеблется от 4 до 12 дн. Описаны 2 формы ее клинической стадии - острая и хроническая.
   В острых случаях, начинающихся с лихорадки (40,5-41°С), температура тела заболевшей собаки после кратковременного подъема часто снижается до или ниже нормального физиологического уровня. Несмотря на это, у животных с самого начала отмечают резкую слабость. Больные собаки отказываются от корма, но много пьют. Как правило, имеет место кровавый понос, но иногда развивается запор. Рвота отсутствует. В подавляющем большинстве случаев болезнь протекает без явной желтухи, хотя иногда может наблюдаться слабое окрашивание слизистых оболочек животного в желтоватый цвет.
   При более часто встречающейся хронической форме болезнь начинается упорной рвотой, потерей аппетита, усиленной жаждой, а также резким упадком сил, который переходит в сонливое или ступорообразное состояние.
   По мере развития болезни прогрессируют исхудание и дегидротация организма, кожа становится сухой и теряет эластичность.
   На 3-5 дн болезни на остающейся сухой слизистой оболочке рта (особенно деснах, языке и губах) появляются гиперемированные участки неправильной формы, покрывающиеся бледно-желтыми или грязно-серыми струпьями. В результате некроза на месте последних возникают язвы, проявляющие тенденцию сливаться друг с другом. Нередко на деснах образуется темно-красная кайма. Развитие описанных изменений слизистой оболочки сопровождается появлением зловонного запаха изо рта, напоминающего запах мочи, и местными кровотечениями. Снижается осмотическая резистентность эритроцитов (95).
   Отмечают спазмы желудочно-кишечного тракта. Диарея зачастую может переходить в запор, возможна мелена.
   Увеличиваются шейные лимфатические узлы. Как при остром, так и при хроническом течении болезни развиваются клинические признаки острой или подострой почечной недостаточности: моча выделяется в небольших количествах, имеет необычный (от лимонного до оранжевого) цвет, содержит до 0,2% белка. Тяжелое поражение почек служит причиной азотемической уремии. С развитием последней связано появление тремора, переходящего в клонико-тонические судороги, начинающиеся с мускулатуры головы, а затем распространяющиеся на мышцы всего тела.
   Средняя продолжительность болезни составляет 8-10 дн, хотя описаны также случаи гибели животных как в первые 3-6 дн, так и в конце 2-3 нед болезни. При отсутствии своевременного лечения летальность достигает 60-90%: в начале вспышки болезни она наиболее высока, а в последующий период заметно снижается. Неблагоприятными в прогностическом плане признаками считают быстрое развитие симптомов болезни, сильную депрессию, понос и высокий титр мочевины в крови.
   Молодые животные переносят болезнь легче, чем взрослые. Процесс выздоровления обычно длительный - может достигать 2-3 нед. У части выздоровевших собак долго сохраняются расстройство пищеварения, хронический нефрит, изредка парез или паралич 1 тазовой конечности.
   Как отмечалось ранее, в настоящее время происходит вытеснение серовара canicola другими сероварами ЛС, вызывающее заболевание весьма сходное по симптоматике со штутгардской болезнью. В Европе и США неуклонно повышается инцидентность инфекции серовара grippotyphosa L.kirschneri (особенно северо-восточных штатах), а в других районах США - серовара L.pomona, в Австралии - серовара L.australis, способных вызывать у собак острую почечную недостаточность.
   Инфекция сероваров L.borgpetersenii, по-видимому, не имеет большого клинического значения. Так, например, у собак, инфицированных сероваром sejroe, несмотря на развитие интерстициального нефрита, симптомов болезни не развивается, а цитологические и биохимические показатели крови и мочи не меняются (96).

Желтушный лептоспироз
   Ровно через 20 лет после вспышки штутгартской болезни в Германии в Англии была описана желтушная форма лептоспироза собак, названная болезнью Вейля. Этиологическим агентом болезни оказался другой серовар ЛС - L.ichterohaemorrhagie.
   Инкубационный период инфекции длится 2-20 дн. Она протекает остро, реже - хронически.
   В начале клинической стадии болезни происходит повышение температуры тела. Лихорадка носит ремитирующий субфебрильный характер (39,5-40°С) и не всегда выявляется владельцами заболевшего животного. В большинстве случаев развиваются слабость, апатия, миалгия, понижается аппетит, нередко появляются рвота и диарея.
   В конце первой недели лихорадка прекращается (температура тела животных снижается иногда ниже нормального физиологического уровня) и появляется характерный симптом болезни - желтушность видимых слизистых оболочек, а у собак с непигментированным кожным покровом - меняется цвет кожи. Лишь в единичных случаях желтуха отсутствует (3). У больных собак, как правило, выявляют увеличение печени и селезенки.
   Одновременно темнеет и становится пенистой моча. В ней выявляют эритроциты, эпителий почек и мочевого пузыря, иногда почечные цилиндры на фоне повышения концентрации белка и желчных пигментов.
   На слизистых оболочках и коже могут появляться кровоизлияния. Нередко у заболевших собак наблюдают носовое кровотечение и примесь крови в рвотных массах. В наиболее тяжелых случаях развивается диссеминированная внутрисосудистая коагуляция, ведущая к гибели животного.
   Продолжительность клинической стадии инфекции в среднем составляет 2-10 дн. При отсутствии лечения болезнь может закончиться летальным исходом уже на 5-6 дн клинической стадии, или она принимает хроническое течение, при котором развивается кахексия. До разработки эффективных методов лечения летальность собак при болезни Вейля достигала 40-60%.
   В последнее время помимо расширении распространения среди собак сероваров ЛС (например, в Австралии серовара autumnalis L.interrogans), вызывающих симптоматику болезни Вейля, все чаще регистрируют нетипичную желтушную форму инфекции серовара grippotyphosa L.kirschneri.


И М М У Н И Т Е Т
   Ключевую роль в защите организма собаки от лептоспироза играют факторы гуморального иммунитета, особенно антитела к антигенам наружной оболочки ЛС (9). Антитела в присутствии комплемента агглютинируют и опсонизируют ЛС, что делает их уязвимыми для фагоцитов. Деятельность последних, таким образом, необходима для элиминации возбудителя из организма, но носит антителозависимый характер. Захваченным макрофагами патогенным ЛС часто удается избежать гибели. Кроме того, они запускают механизм апоптоза последних.
   Протективный иммунитет имеет серовароспецифический характер: несмотря на наличие перекрестных серологических реакций, вакцинация 1 из серотипов или применение антисыворотки к нему, а также перенесение естественной инфекции не создают надежной защиты от заражения другими сероварами ЛС.
   Собаки при остром течении инфекции имеют высокий титр lgM-антител и относительно низкий титр lgG-антител. У привитых или ранее переболевших лептоспирозом животных соотношение титров антител этих классов противоположное (119). Титр IgM-агглютининов у инфицированных животных повышается в течение первых 2 нед инфекции, а затем быстро снижается (13). Тем не менее, они могут сохраняться на выявляемом серологическими тестами уровне в крови переболевших собак несколько лет. Антибиотикотерапия, проводимая в ранние сроки инфекции, в значительной степени ингибирует сероконверсию собак.
   Важную роль в уничтожении ЛС нейтрофилами играют дефензины. Этот процесс имеет кислородо-независмый механизм (123).
   Вакцинация цельноклеточными бактеринами индуцирует серовароспецифический и, в меньшей степени, серогруппоспецифический протективный иммунитет против лептоспироза. Поствакцинальная реакция проявляется повышением титра специфических сывороточных агглютинирующих и опсонизирующих антител к липополисахариду и поверхностным протеинам ЛС. Титр этих антител сохраняется у большинства привитых собак на протяжении 4-6 мес (после однократной вакцинации) и до 1-2 лет (после ревакцинации).
   С помощью моноклональных антител в молекуле липополисахарида ЛС обнаружили агглютиногенные (9), опсонизирующие (37) и протективные (54) эпитопы. Поэтому не удивительно, что субъединичная липополисахаридная вакцина защищает от инфекции ЛС гомологичной серогруппы значительно лучше, чем лептоспирозные бактерины (103). Липополисахарид теряет свою протективную иммуногенную активность после обработки 2М муравьиной кислотой при 100 ?С в течение 2ч или периодатом калия при 4 ?С в течение 40 ч (66).


П А Т О М О Р Ф О Л О Г И Я

Желтушный лептоспироз
   При остром течении болезни на вскрытии обнаруживают картину септицемии с ярко выраженной желтухой. Видимые слизистые оболочки, особенно конъюнктива, часто имеют медно-красный цвет, обусловленный застоем крови и желтухи. Желтушно окрашены и все остальные органы, кроме головного мозга и его оболочек. Множественные точечные кровоизлияния можно встретить в разных органах, но чаще в легочной плевре. Селезенка несколько увеличена, хотя ее пульпа, как правило, не подвергается заметным патоморфологическим изменениям. Сердечная мышца пестро окрашена вследствии наличия серых пятен на поверхности и на разрезе. Почки увеличены, имеют дряблую консистенцию и серо-желтый цвет без резких границ между слоями, их капсула легко снимается.

Безжелтушный лептоспироз
   При уремической форме болезни на всрытии прежде всего находят язвенный стоматит - уплощенные участки некротизированной слизистой оболочки локализуются на задней поверхности языка, щек и губ. Они имеют серый цвет. Чем больше таких очагов, тем сильнее запах разлагающейся мочи из ротовой полости; такой же запах ощущают при всрытии других полостей тела собаки. Почти всегда находят характерные для геморрагического гастроэнтерита изменения. Слизистая оболочка желудка, 12-перстной, ободочной и прямой кишок отекшая, резко покрасневшая, часто черно-красная и пронизанная кровоизлияниями. Те же, но менн выраженные изменения обнаруживают в тонкой и слепой кишках. Характерен отек селезенки и лимфатических узлов (особенно брызжеечных).
   Поверхность почек мелкобугристая, капсула снимается с трудом. На разрезе в корковом слое видны серые, радиально ориентированные тяжи. Патологогистологическая картина характерна для острого гломерулонефрита или (при затяжном течении болезни) хронического интерстициального нефрита. На первый план выступает дегенерация почечных канальцев. Кроме того, в корковом веществе почек выявляют легкую интерстициальную лимфоцитарную инфильтрацию (72).
   Печень опухшая, может быть покрыта желто-бурыми пятнами и кровоизлияниями. При гистологическом исследовании в ней выявляют некроз гепатоцитов и застой желчи.
   Гиперемированная поджелудочная железа бывает испещрена небольшими желтоватыми очажками.
   Сердечная мышца часто ломкая и испещрена серовато-желтыми полосами. Эндокард левого предсердия всегда утолщен, поверхность его шероховата, мутна, окрашена в серовато-желтый цвет, иногда покрыта сгустками крови. Язвенный париетальный эндокардит локализуется исключительно в левом предсердии, а в других отделах сердца изменений не выявляют. Изменения, сходные с наблюдающимися в эндокарде левого предсердия, обнаруживают еще почти в 1/3 случаев в легочной артерии в форме некротизирующего эндартериита. Они имеют вид буровато-желтых мутных с поверхности и слегка возвышающихся участков на интиме артерии вблизи ее выхода из правого желудочка.
   Изменения органов дыхания выявляют приблизительно в 30% случаев. В слизистой оболочке гортани между голосовыми связками и в верхней трети трахеи на передней поверхности ее стенки появляется продольная складчатость, мелкая бугристость, а иногда образуются уплотненные узелки. В последних на разрезе видны отложения извести. На реберной плевре в межреберных промежутках выявляют утолщения серого цвета в форме бляшек и полос.
   В отдельных случаях в головном мозге обнаруживают легкий, диффузный негнойный менингит.


Д И А Г Н О С Т И К А
   Прижизненный диагноз на лептоспироз ставят комплексно с использованием эпизоотологических и клинических исследований, обнаружения возбудителя посредством микроскопии мазков крови или мочи в темном поле, а также на основании установления высокого титра специфических антител или сероконверсии.

Обнаружение лептоспир
   Постмортально обнаружить и изолировать возбудителя удается из различного секционного материала, но предпочтение отдается почкам, печени, селезенке и лимфатическим узлам.
   В практику лабораторной диагностики лептоспироза в медицине и ветеринарии все шире внедряются новые методы обнаружения ЛС. К их числу относятся иммунохимические (РИФ, иммунофосфатазный и иммунопероксидазный тесты, иммунологическое окрашивание золотом) (34, 83, 102, 128), электронная микроскопия, ПЦР и ДНК-зондирование (109).

Бактериоскопия
   ЛС можно обнаружить темнопольным или фазовоконтрастным микроскопированием. Основной способ исследования - метод раздавленной капли в темном поле (ПРЛ 10:1.3). В практике диагностических лабораторий окрашивания ЛС почти никогда не проводят.
   Из-за низкой концентрации ЛС редко удается обнаружить микроскопией препаратов крови и, как правило, только в первые 1-3 дн болезни. Поэтому используют несколько методов концентрирования возбудителя из обработанной гепарином крови:
   а) отстаивание смеси в узкой пробирке в течение 1ч с последующим микроскопированием не менее 10 раздавленных капель верхнего прозрачного слоя;
   б) центрифугирование при 10000-12000 об/мин в течение 1 ч с последующим исследованием осадка.
   Частота обнаружения ЛС в моче максимальна в период явного изменения ее цвета (потемнения). Микроскопируют в темном поле свеже собранную мочу или, что повышает вероятность обнаружения агента, полученный центрифугированием (10000-12000 об/мин в течение 1 ч) осадок мочи. Исследуют 10-20 препаратов раздавленной капли. Обнаружение ЛС в моче имеет наибольшее значение для выявления лептоспироносителей с хронической формой инфекции.
   Легче всего обнаружить ЛС в печени и почках (поверхностном слое). Материал для исследования берут в кратчайшие сроки после гибели животного, поскольку трупное обсеменение вызывает быструю гибель этих бактерий. Для микроскопического исследования в темном поле на предметных стеклах готовят препараты раздавленной капли из взвесей тканей органа в физиологическом растворе. Для выявления ЛС в гистосрезах печени и почек применяют методы серебрения по Левадити или Вартин-Старри (ПРЛ 14:1.1). При этом ЛС окрашиваются в темно-коричневый цвет и хорошо видны на фоне золотистых тканей при просмотре в светлом поле под иммерсией.
   Несмотря на то, что из-за низкой концентрации ЛС в довольно большом количестве случаев лептоспирозной инфекции собак бактериоскопия дает отрицательный результат, ценность этого метода неоспорима, т.к. он позволяет поставить диагноз в течение 1-1,5 ч.

РИФ
   Использование РИФ облегчает обнаружение ЛС в патологическом материале (секционном материале, а также осадке, полученном после центрифугирования мочи, крови, других ликворах) и кормах. Широкому применению теста мешает отсутствие выпускаемых биопредприятиями диагностикумов, необходимых для его проведению.

Авидин-биотин иммунопероксидазный тест
   Сочетает в себе преимущества гистологического и иммунологического исследований. Этим способом легче всего обнаружить ЛС в тонких срезах почек, хотя можно тестировать и другой патологический материал (83).

ПЦР
   Характеристика этого молекулярного метода диагностики лептоспироза приведена ниже. Обычно в нем исследуют мочу и кровь собак.

Изоляция возбудителя
Получение чистых культур
   Изоляция ЛС из патологического материала посевом на питательные среды является одним из наиболее чувствительных методов диагностики инфекции. Но для получения хороших результатов необходимо отсутствие антибиотиков в тестируемом патологическом материале, своевременное взятие (до начала автолиза) и правильное (при 4°C) хранение последнего. В случае исследования мочи важно также значение ее рН, как фактора, способного инактивировать бактерии. По той же причине для консервирования крови, предназначенной для проведения бактериологического анализа, применяют не ЭДТА или лимонную кислоту, а не гепарин. Пероральная дача животному гидрокарбоната натрия накануне взятия от него мочи или крови для бактериологического исследования повышает его результативность (110).
   Жидкая питательная среда с 1% бычьего альбумина и 200 мкг/мл 5-флуорацила служит одной из лучших транспортных сред.
   Для первичной изоляции ЛС предпочтение отдается жидким и полужидким средам. С этой целью могут быть применены селективные среды. Однако на последних может ингибироваться рост не только посторонней микрофлоры, но и ЛС (особенно в случаях низкого их титра в патологическом материале). Поэтому при первичной изоляции ЛС в селективных целях часто пользуются безсывороточными средами.
   Выделение ЛС из крови инфицированных собак не всегда дает положительный результат из-за кратковременности бактериемии и развития последней в период, когда клинические признаки могут отсутствовать. Выделение гемокультуры проводят в первые 4 дн болезни, для чего 5-10 мл венозной крови засевают на 10 пробирок с питательной средой (обычно для этого используют среду Ферворта-Вольфа).
   Из мочи ЛС можно изолировать на 2-3 нед болезни. Получение отрицательного результата бактериологического анализа мочи еще не говорит об отсутствии носительства ЛС, т.к. их титр может быть низким. Для повышения эффективности бактериологического анализа мочи рекомендуется предварительно дать обследуемому животному диуретик (75).
   Изоляция ЛС из тканей абортированных плодов или мертворожденных щенков свидетельствует об инфицированности суки.
   Оптимальная температура инкубирования посевов составляет 28-30°С, а при подозрении на инфекцию сервара canicola - 30-32°С.
   Продолжительность культивирования первичных посевов достигает 12-24 нед, а субпассажей - 5-15 дн. Контроль посевов на присутствие ЛС осуществляют микроскопированием проб в темном поле, проводимом с интервалом в 1-2 нед. Продолжительность бактериологического исследования увеличивается в за счет необходимости идентификации выделенных изолятов. Цель последней состоит в дифференциации сапрофитных и патогенных ЛС, а также определении их видовой, серогрупповой и сероваровой принадлежности.

Биопроба
   ЛС могут быть выделены из патологического материала посредством его инокуляции лабораторным животным: кроликам-сосунам, золотистым хомячкам, степным пеструшкам (10-30-дневного возраста) и сусликам, поскольку перечисленные животные в равной степени чувствительны к возбудителям как "желтушных", так и "безжелтушных" лептоспирозов. Другие виды лабораторных животных проявляют неодинаковую чувствительность к разным сероварам ЛС. Молодых морских свинок и белых мышей (массой 10-14 г) используют при подозрении на инфекцию серовара icterohaemorrhagiaee.
   Гепаринизированную кровь, мочу, спиномозговую жидкость или суспензию гомогената внутренних органов подозреваемой в заражении ЛС собаки, а также тестируемые корма и воду вводят лабораторным животным подкожно, через скарифицированную кожу, закапыванием в глаза, внутрибрюшинно, внутривенно, интракардиально и перорально.
   У молодых кроликов, золотистых хомяков и сусликов инфекция "желтушных" и "безжелтушных" ЛС вызывает развитие таких же клинических и патоморфологических изменений, как и у других видов лабораторных животных при инфекции L.icterohaemorrhagiaee. После инкубационного периода, составляющего в зависимости от патогенности штамма агента от 2 до 7 дн (реже более) температура тела поднимается до 39-41°С, животные отказываются от корма и быстро теряют в весе. У них развивается инъекция сосудов склеры глаз. На 2-5 дн клинической стадии инфекции на фоне резкого истощения температура их тела снижается ниже нормы, появляется желтушность склеры глаз, видимых слизистых оболочек и кожи. Усиленно выпадают волосы. Заболевшие животные в большинстве случаев погибают на 4-12 дн пз.
   На их вскрытии обнаруживают желтушность тканей, особенно подкожной клетчатки, кровоизлияния во внутренних органах, коже, подкожной клетчатке, которые наиболее интенсивны в паховой и подмышечной областях. Типичны крупноточечные кровоизлияния в легочной ткани, которые выделяясь на общем ишемическом фоне придают легким сходство с крыльями бабочки. В печени находят красновато-желтые некротические очаги. Вследствии острого нефрита почки увеличены, надпочечники гиперемированы.
   В течение инкубационного периода и всей клинической стадии инфекции ЛС циркулируют в крови животного. С появлением желтухи их обнаруживают во внутренних органах (особенно часто в печени).
   В ходе биопробы по рекомендациям ВОЗ за подопытными животными ведут следующие наблюдения:
1) определяют массу тела до опыта и ежедневно в течение всего эксперимента;
2) у крупных животных (кроликов, морских свинок) дважды в сутки измеряют ректальную температуру. При ее повышении проводят микроскопию на наличие ЛС брюшного эксудата. Его собирают стерильной пастеровской пипеткой через надрез кожи, сделанный выше пупка (для избежания травмы мочевого пузыря);
3) высевают взятую из сердца кровь в пробирки с питательной средой . За выжиывшими животными ведут наблюдение в течение 1 мес, а затем подвергают эутаназии. Высевают на питательные среды гомогенат коркового слоя почек и проводят его микроскопическое исследование с целью обнаружения ЛС. Кровь из сердца исследуют на наличие специфических антител в РАЛ.
   Для обнаружения патогенных ЛС в воде и иле водоемов пользуются методом Аппельмана-ван Тиля, сущность которого состоит в купании в течение 1 ч морских свинок со скарифицированной на площади в 10-20 см2 кожей брюшка. Кожу скарифицируют после удаления волос нанесением скальпелем продольных и поперечных штрихов. За животными ведут наблюдение по общим правилам. В связи с легкостью клинического течения лептоспироза у морских свинок, вызванного "безжелтушными" штаммами агента, независимо от состояния животных проводят посевы на питательные среды из крови сердца с 4-5 по 20 дн пз и микроскопирование брюшного эксудата.
   В случае получения сомнительных результатов биопробы, что может иметь место при плохой сохранности поступившего для исследования патологического материала, низкой патогенности тестируемого штамма ЛС или вследствии низкой заражающей дозы, прибегают к проведению 1-2 последующих пассажей на лабораторных животных.

Идентификация вирулентных ЛС
   Патогенные и сапрофитные изоляты ЛС дифференцируют по результатам биопробы, чувствительности к 8-азагуанину, бикарбонату натрия, солям меди, нитрату серебра, кобальту, сулеме и литию, гемолитической и липазной активности, солевой и температурной толерантности, суммарному содержанию гуанина и цитозина в ДНК.
   Вирулентность входящих в состав сероваров штаммов ЛС варьирует в широких пределах. Поэтому чрезвычайно важным представляется поиск маркеров их вирулентности на штаммовом уровне. 1 из таких маркеров может служить белок с мМас 30кД, входящий в состав гликолипопопротеина вирулентных штаммов ЛС. У авирулентных штаммов вместо него экспрессируется белок с мМас 20 кД (40). Установлено также, что синтез трансмембранного наружного мембранного протеина у авирулентных штаммов происходит значительно интенсивнее, чем у вирулентных штаммов ЛС, а протеины с мМас 45 и 32-34 кД, наоборот, являются маркерами вирулентности этих спирохет (41).

Типирование
   Патогенные штаммы ЛС относят к определенным сероварам и серогруппам по результатам их серотипирования. Дифференциацию сероваров осуществляют при помощи реакции перекрестной агглютинации-абсорбции, авидин-биотин пероксидазного теста или ПЦР.

Серотипирование
   Разделение ЛС на серогруппы осуществляют по результатам перекрестной реакции агглютинации-лизиса (РАЛ). Деление серогрупп на серовары проводят в тесте адсорбционной агглютинации (РАА), с помощью антисывороток, моноклональных антител (108), рестрикционного эндонуклеазного анализа (48) и ПЦР (17, 61).
   Моновалентные антисыворотки к серогруппам и сероварам получают иммунизацией кроликов культурами соответствующих штаммов ЛС (31). Детали метода иммунизации приведены в ПРЛ 10:4.1
   Перекрестную РА ставят со всеми известными серогруппами и сероварами ЛС. Сравнение величины титров агглютинации-лизиса музейных и тестируемого штаммов ЛС моновалентными антисыворотками позволяет установить степень родства между ними. В случае, когда тестируемый изолят не проявляет серологического родства с музейными штаммами ЛС, его определяют как оригинальный серовар.
   РАА основана на адсорбции агглютинирующих антител из моновалентных сывороток формалинизированным бактерином музейного и тестируемого штаммов ЛС. Их выращивают в жидкой среде с полисорбатом-80 и бычьим сывороточным альбумином при температуре 29°C. Антиген готовят из 4-8-дневных культур. Смесь (1:9) антисыворотки с титром не более 1:3000 и сконцентрированного центрифугированием в 60-70 раз антигена выдерживают при температуре 37°С в течение 18 ч, центрифугируют (30 мин при 10000 об/мин ) и тестируют в РАА. Снижение первоначального титра сыворотки соответствует ее истощению тестируемым штаммом. Перекрестную реакцию с истощенными сыворотками ставят по обычной схеме в ряде возрастающих разведений (1:100, 1:500 и т.д.). Оценку результатов проводят по следущим критериям:
   а) при идентичности музейного и тестируемого штаммов они полностью сорбируют антитела из гомологичной и гетерологичной антисывороток;
   б) сравниваемые штаммы относят к разным серотипам, если 10% или более гомологичного титра антител обнаруживается в каждой из 2 (гомологичной и гетерологичной) истощенных сывороток;
   в) сравниваемые штаммы относят к разным подтипам одного серотипа, когда 1 антисыворотка после истощения гетерологичным штаммом сохраняет менее 10% гомологичного титра, а другая -10% или более гомологичного титра.

Молекулярные методы типирования
   ДНК-гибридизация позволила разделить патогенных ЛС, первоначально входивших в состав вида L.interrogans sensu lato на 8 видов (127). В последующем генетические методы стали применять для типирования ЛС на подвидовом уровне. С этой целью использовали эндонуклеазный анализ генома ЛС в рестрикционном зонально-фиксированном гель электрофорезе (111), пульсовом зональном гель электрофорезе (48), ДНК-гибридизации с применением повторяющихся последовательностей нуклеотидов (81) и риботипирования (84).
   Перечисленные методы не могли быть использованы для рутинной идентификации сероваров ЛС - с этой целью была применена ПЦР (88). Референтные штаммы ЛС сгруппировали на основании составления карты полиморфизма рестрикционных сайтов в ПЦР-амплифицированных генах рибосом. ПЦР в зависимости от использованного праймера (ПРЛ 10:5) позволяет выявлять в патологическом материале и идентифицировать патогенные ЛС на видовом, серогрупповом, сероварном и штаммовом уровнях (17, 61, 107). Для L.interrogans наиболее удобным маркером оказался ампликон RSPI2 праймера RSP размером около 390 пар оснований. Для идентификации L.borgpetersenii применяют зонд PR1B3, являющийся фрагментом праймера PR1 размером 680 пар оснований. Для L.kirschneri с той же целью был использован праймер KG размером 760 пар оснований (61). Перечисленные генетические маркеры отличаются высокой испецифичностью и позволяют идентифицировать практически все серовары ЛС, способные вызвать инфекцию у собак. Исключение составляют лишь серовары panama и shermani, относящиеся к L.noguchii и L.santarosai, соответственно.
   С помощью ПЦР диагноз на лептоспироз может быть поставлен на основании результатов исследования всего 500 мкл крови уже через 2 дня после заражения. Ее чувствительность составляет 1-100 кл/пробу (56).
Пока еще ПЦР проводит ограниченное количество лабораторий, оснащенных специальными оборудованием и реактивами, имеющих референтные пробы ДНК возбудителей лептоспироза и соответствующие праймеры.

Серологическая диагностика
   Лептоспироз может быть диагностирован также на основании обнаружения высоких титров специфических антител или сероконверсии. Кроме того, серологические тесты применяют для контроля экспериментальной инфекции лабораторных животных и типирования выделенных изолятов ЛС. Они позволяют поставить диагноз на лептоспироз в вариабельные сроки после начала болезни, определяемые динамикой антител, выявляеых используемым тестом. Специфические агглютинины и лизины обычно появляются в крови не ранее 7-8 дн после начала болезни.
   Наличие противолептоспирозных антител в крови ранее прививавшихся и переболевших лептоспирозом собак не позволяет интерпретировать однократно полученные положительные результаты серологического исследования. Поэтому требуется повторное серологическое исследование больного животного через 3-5дн и более отдаленные сроки. Диагностическим считается установление 4-кратного изменения титра сывороточных антител при тестировании парных проб сыворотки крови. Необходимо иметь в виду, что у подвергавшихся антибиотикотерапии собак процесс образования антител к ЛС может быть заторможен по времени и интенсивности. Антитела к ЛС персистируют в крови собак в течение многих месяцев, а порой даже лет. У хронически инфицированных ЛС животных титры специфических антител могут снижаться ниже уровня, выявляемого рутинными методами серологической диагностики.
   Для серологической диагностики лептоспироза применяют различные варианты РА (РАЛ, макроагглютинации, микроскопической аггглютинации, РЛА), РСК и ЭЛИЗА.

РА
   Для постановки РА необходим набор живых культур патогенных для собак сероваров ЛС, циркулирующих на данной территории. Важнейшими факторами, определяющими специфичность РА, являются чистота и идентичность антигенов. Последнюю контролируют в лабораториях не реже 2 раз в год с применением гипериммунных кроличьих антисывороток или моноклональных антител. Чистоту антигенов ЛС регулярно проверяют посевами на кровяной агар или тиогликолевый бульон.
   Музейные культуры ЛС можно хранить в жидком азоте при -70°C или в лиофилизированном виде. Частые пересевы на жидких средах нередко ведут к потере ими антигенности. В таком случае вновь возвращаются к работе с музейным штаммом.
   Основными недостатками РА при лептоспирозе являются значительные затраты времени и труда на ее постановку, необходимость применения большого количества антигенов ЛС разных серогрупп, вариабельность качества используемых живых лептоспирозных антигенов, потенциальную опасность заражения проводящих серологическое исследование специалистов (при использовании в качестве антигена живых культур ЛС), субъективность оценки результатов, возможность перекрестных реакций сероваров, относящихся к разным серогруппам и недостаточно высокую чувствительность (например, при исследовании животных, выделяющих возбудителя с мочой, но не имеющих выраженного антительного ответа). Последнее связано с динамикой IgM-агглютининов (IgG в РА не выявляют).
Разработано несколько описанных ниже вариантов теста.
1. РАЛ
   Со времени разработки Мартином и Петтитом в 1918г этот тест остается "золотым стандартом" серологической диагностики лептоспироза (ПРЛ 10:3.1).
   Для получения антигена для РАЛ используют 7-10-дневные культуры ЛС, выращенные на жидких питательных средах и имеющие пышный рост (не менее 50 ЛС в поле зрения без спонтанной агглютинации и примесей).
   Агглютинация проявляется склеиванием ЛС в агломераты, размер которых может варьировать от 3-5 бактерий до огромных шаров, занимающих несколько полей зрения микроскопа. Лизис сначала проявляется образованием зернистости у одиночных и агглютинированных ЛС. Затем бактерии постепенно теряют подвижность и фрагментируются, превращаясь в скопление аморфных зернистых образований. Агглютинация и лизис протекают в первых разведениях сыворотки одновременно, но по мере увеличения разведения сыворотки начинает преобладать агглютинация так, что в конечных разведениях лизис отсутствует (рис.61).
   Специфические агглютинины появляются в крови собак через 7-10 дн после заражения. У непривитых собак в этот период титр агглютининов обычно невысок (1:100 - 1:200), но в последующем он быстро возрастает до 1:400 и выше, что считают диагностическим уровнем. Обычно к концу второй недели болезни титр антител повышается в 15-40 раз и выше. На этом уровне он сохраняется несколько недель. В последующем отмечают тенденцию постепенного его снижения. На острой стадии инфекции отмечают 4-кратное повышение титра агглютинирующих антител к ЛС при тестировании парных проб сывороток. Однако при исследовании этим тестом сыворотки хронически больных собак могут быть получены отрицательные результаты из-за низкого титра специфических агглютининов.
   При оценке результатов теста необходимо принимать во внимание большую продолжительность персистенции агглютининов у многих переболевших и привитых, а также возможность отсутствия сероконверсии у части инфицированных животных (43). Стабильные титры антител 1:200 -1:400 выявленные в крови собаки с интервалом в 1-2 нед скорее свидетельствуют о ранее перенесенном заболевании или лептоспироносительстве, чем о текущей инфекции. 4-кратное повышение титра антител считатают доказательством последней.
   Поскольку на динамику антительного ответа большое влияние оказывает интенсивность репродукции ЛС в организме животного, то первое серологическое исследование необходимо проводить до начала антибиотикотерапии и введения противолептоспирозных антисыворотки/Ig. В случаях неспецифической реактивности пробы сыворотки крови собак исследуют повторно после обработки 2-меркаптоэтанолом (110).
   В РАЛ может быть тестирована также моча подозреваемых в заболевании лептоспирозом собак. Однако результаты такого исследования носят ориентировочный характер, поскольку титр специфических антител в моче обычно не превышает 10% титра сывороточных антител.









Рисунок 25.
Реакция агглютинации-лизиса (по 1)
Обозначения:
1 - отрицательная реакция;
2-5 - положительная реакция: различная степень агглютинации и лизиса.







2. Микроскопическая реакция агглютинации (МРА)
   В рутинной лабораторной практике и полевых условиях в настоящее время пользуются не РАЛ, а ее модифицированным вариантом - МРА. Тест проводят в плашках аналогично классической РАЛ, но при учете результатов оценивают лишь степень агглютинации ЛС (ПРЛ 10:3.1).
   С целью снижения риска заражения лабораторных работников разработан также вариант реакции, при постановке которого вместо живых культур ЛС применяют инактивированные 0,2-0,5% формалина бактерины. При оценке результатов МРА учитывают только агглютинацию, поскольку формалинизированные ЛС не лизируются сывороткой. Из-за недостаточно высокой чувствительности эта модификация теста не нашла широкого применения.
   Вместо набора антигенов разных сероваров патогенных ЛС при постановке теста может быть использован единственный антиген, которым служит штамм Patoc 1 непатогенного вида L.biflexa (118). Реакция позволяет лишь установить принадлежность тестируемого изолята к ЛС.
3. Реакция макроагглютинации (РМА)
   Этот вариант РА проводят с жидкими культурами референтных сероваров ЛС, в которых рост бактерий проявляется видимой при встряхивании пробирки мутью. После добавления в них разведения (1:10) гомологичной антисыворотки в соотношении 1:5 из агглютинировавших ЛС быстро образуются хлопья, сохраняющиеся несколько суток и полностью не распадающиеся даже при энергичном встряхивании пробирок.
   В модификации Смита-Тулоша (1937 г) реакцию проводят 3ч при температуре 37?С, а затем 30 мин при 55?С и учитывают результаты с помощью лупы при непрямом освещении.
   Старбук и Уорд (1942 г) предложили проводить тест с формалинизированными культурами ЛС. Обработанные формалином ЛС осаждают центрифугированием и окрашивают генцианвиолетом. При постановке реакции смешивают по 1 капле антигенов и тестируемой сыворотки на стеклянной пластинке белого цвета. Ее осторожно покачивают в течение 10 мин и проводят учет результатов. Положительной реакцией считают появление в смеси рыхлых, окрашенных в синий цвет агрегатов.
4. РЛА
   По чувствительности РЛА несколько уступает РАЛ, но проще в постановке и позволяет получить результат в более короткий срок. Проводится с помощью латексных частиц, на которых сорбируется антиген ЛС (90).
5. РА полимерных частиц с лептоспирозным антигеном.
   Этот современный вариант РА пока еще не нашел широкого применения, хотя получил положительные отклики, как медицинских,так и ветеринарных специалистов (2, 105). В качестве носителя наружных мембранных антигенов ЛС использованы частицы поли-DL-лактид-полиэтиленгликоля, покрытые антигеном ЛС (62). Тест по специфичности соответствует, но несколько уступает по чувствительности РАЛ. Он проще в постановке и позволяет получить результат серологического исследования в течение 3 ч. Кроме того, агглютинины выявляются им в более ранние сроки и в более высоком титре, чем в РА (2).

ЭЛИЗА
   Это очень чувствительный, но в меньшей степени серовароспецифичный тест по сравнению с РА. Последнее обстоятельство требует проверки результатов ЭЛИЗА постановкой РАЛ и МРА.
   В Европе применяют несколько вариантов ЭЛИЗА, позволяющих определять титры lgG- и lgM-антител к различным сероварам ЛС (45). Тест выявляет lgM к ЛС уже через 7 дней после заражения животного, когда специфические агглютинины еще не достигают диагностического титра. В ЭЛИЗА диагностическим считают титр антител ?1:320 (119).
   Тест выявляет неагглютинирующие родо- и видоспецифические антитела к ЛС (9). Использование родоспецифического антигена дает возможность обнаружить антитела к разным сероварам ЛС (93). Применение в качестве антигена экстракта наружной оболочки ЛС, напротив, позволяет идентифицировать серотип вызвавшего инфекцию возбудителя (45).
   Фирма Biogal выпускает набор реагентов Immunocomb для серологической диагностики лептоспироза собак в ЭЛИЗА. Он предназначен для ускоренного (за 40 мин) выявления инфицированных животных и для оценки уровня их гуморального иммунитета.
   Фирма INDX производит набор диагностикумов Leptospira Dip-S-Ticks для серологической диагностики лептоспироза людей в ЭЛИЗА. Преимуществом этого варианта иммуноферментного анализа служит то, что в нем использован родоспецифический антиген, изготовленный из серовара patoc I непатогенного вида L.biflexa..

РСК
   РСК редко используют для серологической диагностики лептоспироза собак. Комплементсвязывающие антитела появляются у инфицированных сероварами icterohaemorrhagiaee и canicola животных этого вида через 4 дн после заражения, а через 9-10 нед пз они исчезают. Тест не позволяет дифференцировать серовары ЛС (43).
   При постановке РСК большое значение имеет концентрация ЛС в антигене. Поэтому для приготовления последнего отбирают только те культуры ЛС, в которых при темнопольном микроскопировании в 1 поле зрения видно не менее 50-100 бактерий. Для получения ориентировочного результата РСК проводят с пулом антигенов разных сероваров (полиантигеном), но при необходимости установления серотипа/серовара ЛС, вызвавшего инфекцию у животного, для постановки теста пользуются моновалентными антигенами, приготовленными из референтных штаммов, относящихся к определенным серогруппам/сероварам (ПРЛ 10:3.2)..

РНИФ
   РНИФ апробирована в медицинской практике диагностики лептоспироза (12), но при лептоспирозе собак пока не нашла применения. Недавно для серологической диагностики лептоспироза был предложен новый вариант этого теста - реакция флюоресцентной поляризации. В качестве антигена при ее проведении пользуются флагелином ЛС. При соединении флюоресцирующих антител с комплексом антиген-антитело из-за возрастания гидродинамического объема образуемого комплекса увеличивается флюоресцирующая поляризация. Эти изменения автоматически регистрируют флюоресцентным поляризационным анализатором. Тест выявляет специфические IgM-, IgG- и IgA-антитела (25). Реакция проявила себя, как чувствительный, специфичный, не нуждающийся в дорогостоящих реагентах и позволяющий быстро получить результат тест.


Л Е Ч Е Н И Е
   Наилучший терапевтический эффект при лептоспирозе собак достигается комбинацией средств специфической и симптоматической терапии.

Специфическая терапия
   Средства специфической терапии (антисыворотка/Ig и антибиотики) предназначены для элиминации возбудителя из организма. Их применение наиболее эффективно на острой стадии инфекции, когда у заболевших животных уровень гуморального иммунитета еще не достиг достаточно высокого уровня, а в органах и тканях не развились тяжелые поражения.
   Противолептоспирозные сыворотка или иммуноглобулины вводят заболевшей собаке подкожно в сочетании с антигистаминными препаратами 2-кратно с интервалом в 12-24 ч. Лучший терапевтический эффект дает применение препарата на ранней стадии инфекции (не позднее 4-6 дн с начала клинической стадии инфекции).
   В период лептоспиремии антибиотиками выбора являются прокаин пенициллин G, дигидрострептомицин и стрептомицин. Пенициллин вводят животным внутримышечно или подкожно с интервалом в 24 ч в дозе 40000-80000 ЕД/кг (или при выраженной почечной недостаточности - в половинной дозе в 4 приема с интервалом в 12 ч). Стрептомицин и дегидрострептомицин вводят животным внутримышечно в дозе 10-15 мг/кг (1 раз в день на протяжении 2 нед). При тяжелых поражениях почек применять их не рекомендуется.
   Вместо названных антибиотиков могут быть использованы ампициллин или амоксициллин, которые инокулируют внутривенно в дозе 22 мг/кг каждые 6-8 ч. Продолжительность их применения при лептоспирозе обычно составляет 14 дн, или курс завершается после исчезновения азотемии (104). Использование ампициллина пролонгированного действия (альбипена ЛА) дает такой же эффект, но препарат вводят 1 раз в 2 дн (ПРЛ 2:5.1). Для предотвращения бактерионосительства при отсутствии противопоказаний курс лечения этими антибиотикамим может быть увеличен до 6 нед.
   После 2-недельного курса лечения антибиотиками группы пенициллина или стрептомицином для предотвращения лептоспироносительства целесообразно 2 нед перорально 2 раза в день давать собаке доксициклин в дозе 5 мг/ кг массы тела (92). Препарат не применяют при тяжелых поражениях почек, а также щенным сукам и племенным щенкам (из-за отрицательного воздействия на зубную эмаль и изменение ее цвета).
   Тот же эффект, но в более короткие сроки может быть достигнут сочетанным применением пенициллина с антибиотиками группы фторхинолона (байтрилом - ПЦР 1:6.1 и др.).
   Перспективно использовать для лечения больных лептоспирозом собак макролиды (эритромицин и йозамицин), которые проявляют выраженную лептоспироцидность (18).

Гемодиализ
   Из-за отсуствия в отечественных ветеринарных клиниках специальной аппаратуры этим методом редко пользуются. Однако при лептоспирозе собак он дает быстрый и надежный терапевтический эффект, позволяя избавиться от циркулирующего в крови возбудителяя

Симптоматическая терапия
   В качестве средств симптоматической терапии при лептоспирозе собак применяют:
а) спазмолитики (ношпу, галидор и т.д.);
б) гепатопротекторы (карсил, эссенциале форте, ЛИВ-52 и др.);
в) препараты снижающие воспалительную реакцию: в печени на острой стадии болезни -фламин, для системного эффекта - дексафорт (ПРЛ 2: 5.6).
г) препараты восстанавливающие функцию печени - катозал (ПРЛ 10: 7.1) и др. (гомеобил, перечисленные выше гепатопротекторы);
д) перекись водорода или раствор Люголя для местной обработки некротизированных очагов на слизистых оболочках;
е) противорвотные препараты (церрукал, атропин и др.);
ж) противосудорожные препараты;
з) сердечные препараты;
и) средства нормализующие пищеварение;
к) препараты повышающие свертываемость крови и гомепоэз (викасол и др.).
л) внутривенное введение глюкозы, препятствующее распаду гликогена в печени;
м) поддерживающую жидкостную терапию (внутривенные вливания, подкожные введения, микроклизмы). Особенно важна жидкостная терапия при поражениях почек.

Диетотерапия
   В период переболевания и после него собак держат на низкобелковом, а в случае желтушной формы лептоспироза еще и низколипидном рационе.


П Р О Г Н О З
   При своевременном и рациональном лечении большая часть заболевших лептоспирозом собак выздоравливает за 2 нед. При отсутствии или запоздалой терапии, начатой, когда уже произошли тяжелые поражения печени и почек, животные часто погибают. Наличие у них к моменту заражения ЛС заболеваний другой этиологии, особенно сопровождающихся поражением упомянутых органов, осложняет течение инфекции, затрудняет диагностику и делает прогноз менее благоприятным.


П Р О Ф И Л А К Т И К А
   Для профилактики лептоспироза восприимчивое поголовье собак ежегодно прививают. Особенно важна вакцинация перед началом дачного и охотничьего сезонов, а также при регистрации в данном районе случаев болезни. Первую вакцинацию рекомендуется проводить по достижению щенками 8-11-недельного возраста с последующей ревакцинацией через 2-4 нед. В условиях повышенного риска заражения ЛС собак повторно прививают каждые 6 мес, а в остальных случаях - с интервалом в 1-2 г. Вакцинацию против лептоспироза проводят самостоятельно или в комплексе с вакцинами против вирусных инфекций собак. С этой целью используют отечественные препараты, выпускаемые НПО Нарвак, АО Ветзвероцентр и НПО Биоцентр, а также импортные вакцины - Эурикан (Мериал), Ноби Вак (Интервет), Вангард (Пфайзер), Дурамун (ФортДодж), Командер (БиоКор), Соло-Джек (Бехрингер), Мегавак (Индиан Иммунолоджикалс), Биокан (Биовета), Галакси (Шеринг Плау) и др.
   В производстве и применении лептоспирозных вакцин имеются 2 наиболее важных момента - достижение высокой иммуногенности и минимальной реактогенности (последняя проявляется у части привитых животных аллергической реакцией). Иммуногенность вакцин проверяют на хомяках в возрасте до 3 мес. По рекомендациям ВОЗ препарат вводят им в дозе 1/40 иммуной дозы для собаки. Вакцина должна защищать привитых хомяков от гибели после интраперитонеального введения 10-10000 ЛД50 вирулентных штаммов ЛС, относящихся к гомологичным (по отношению к вакцинным штаммам) сероварам.
   Один из путей повышения иммуногенности лептоспирозных вакцин состоит во включении в их состав гидроокиси алюминия или другого адъюванта. Вторым способом решения данной проблемы является повышение титра лептоспирозных антигенов в препаратах. Так, например, фирма Интервет в 1997г повысила в своих вакцинах Нобивак Лепто и Нобивак RL титр ЛС сероваров canicola и icterohaemorrhagiaе до 109 бакт/мл. Эти высоко концентрированные препараты обеспечивают пролонгированную защиту животных от лептоспироза: в настоящее время в странах ЕЭС ими разрешено ревакцинировать собак с интервалом в 2 г.
   Испытания вакцин Нобивак Лепто (фирмы Интервет) и Эурикан L (фирмы Мериал) показали, что они способны предотвращать развитие у привитых собак лептоспироносительства в случаях, когда заражение ЛС произошло до завершения формирования поствакцинального иммунитета.
   Поствакцинальный иммунный ответ может быть повышен комбинированным применением противолептоспирозных вакцин с иммуностимуляторами. Фирма Байер рекомендует применять с этой целью байпамун (ПРЛ 16:4.1).
   Причиной нежелательных побочных эффектов при проведении вакцинации лептоспирозными бактеринами служат аллергенные свойства антигенов этих бактерий, белков сыворотки крови, которую используют для выращивания культур агентов (20), а также включаемых в состав препаратов консервантов (формалина, фенола, мертиолята). Решение данной проблемы может быть достигнуто использованием сред с низким содержанием сыворотки или вообще без нее, а также отказом от применения консервантов (ПРЛ 10:8.1).
   ЛС удается инактивировать без потери иммуногенности другими способами, например, прогреванием или высоким давлением. Использование ультрафильтрации культур вакцинных штаммов ЛС не только дает возможность концентрировать последние, но одновременно освобождает их от балластных белков. При воздействии на ЛС давления в 2 кбар они инактивируются в течение 1ч. При этом от клетки отделяется наружная мембрана и аксиальные нити. Полученные таким методом препараты безопасны и высокоиммуногенны (100). С положительными результатами проходят испытания экспериментальных вакцин из экстрактов ЛС (21). Фирма Форт Додж пошла в этом направлении еще дальше, заменив цельноклеточные бактерины на создающие протективный иммунитет субъединичные антигены. Это, по данным разработчиков препарата, полностью устранило риск нежелательных побочных реакций у привитых собак.
   Снижение реактогенности лептоспирозных вакцин позволило расширить спектр групп животных, которых можно ими иммунизировать. Так, например, вакцинами Нобивак Лепто и Эурикан L можно прививать даже щенных сук.
   Поскольку иммунитет при лептоспирозе носит серовароспецифический характер, то состав используемой вакцины должен соответствовать спектру лептоспирозных сероваров, циркулирующих среди собак в данном географическом районе. Отечественные и зарубежные производители вакцин против лептоспироза собак традиционно готовят свои препараты из 2 наиболее распространенных сероваров canicola и icterohaemorrhagiaе. В последнее время в связи с изменением эпизоотической ситуации наметилась тенденция включения в состав лептоспирозных вакцин сероваров grippotyphosa и pomona. Первую 4-валентную противолептоспирозную вакцину (Дурамун Макс 4L) начала выпускать фирма ФортДодж.
   Перед проведением вакцинации рекомендуется проведение собакам антгельминтной обработки. Целесообразно предварительно исследовать фекалии животного на наличие глистных инвазий, что облегчает выбор антгельминтика. В противном случае используют комплексные препараты проявляющие широкий спектр активности. Одним из наиболее оптимальных сочетаний компонентов в них является комбинация празиквантела и пирантела (препараты типа азипирина -ПРЛ 10:6.1 и пратела - ПРЛ 16:4.2).
   При контакте непривитых собак с больными лептоспирозом животными с профилактической целью применяют специфические антисыворотку или IgG (2-кратное подкожное введение с интервалом в 12-24 ч).
   Не допускается ввод в питомники инфицированных ЛС собак. В период карантинирования всех вновь поступивших животных проводят их комплексное (клиническое, серологическое, а при наличии возможности и бактериологическое) обследование на лептоспироносительство.
   Собак с осторожностью выгуливают в заболоченных местах и купают в водоемах со стоячей водой. Избегают дачи животным кормов, которые могут быть контаминированы лептоспирами.
   Регулярно проводят дератизацию помещений и территории, на которой содержат и выгуливают собак. Помещения, в которых находились больные животные и использовавшийся для них инвентарь тщательно дезинфицируют.
   Соблюдают меры личной гигиены для предупреждения заражения от животных.


Интересное в сети
 
 
поиск по сайту
 
© 2000-2017 by Oksana&Alexandr Lubenets
программирование - студия дизайна ICOM
 

  Яндекс.Метрика